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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » Western曝光后无条带，跪求指教！！！
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kingsa

木虫 (正式写手)
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随心而动，如风自在
31楼2014-05-14 09:25:20
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kingsa

木虫 (正式写手)
引用回帖:
31楼: Originally posted by kingsa at 2014-05-14 09:25:20
实验条件：
脑组织蛋白是上个月提取的，在-80℃冰箱保存差不多3周后，家裂解液冰浴超声裂解、BCA测浓度、加loading配制上样缓冲液、沸水浴变性，然后分装储存于-20℃冰箱。第二天开始WB实验。

目的蛋白18KD，β ...

以上是我实验条件和整个过程，求各位大神告诉我可能是哪步出了问题？

我昨天借了朋友的抗体，今天重新开工，看看是不是抗体的问题

各位大神，求指教啊！
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随心而动，如风自在
32楼2014-05-14 09:27:54
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dengming1983

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
29楼: Originally posted by 家平 at 2014-05-14 08:42:14
你封闭的是不是有点厉害了
...

就是脱脂奶粉TBS液封闭一小时
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33楼2014-05-15 06:11:37
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家平

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
33楼: Originally posted by dengming1983 at 2014-05-15 06:11:37
就是脱脂奶粉TBS液封闭一小时...

浓度高吗，调低试试

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修身，齐家，治国，平天下
34楼2014-05-15 08:50:48
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shaozhenjun

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

5%脱脂奶粉封闭步骤最好在摇床进行哈，你这个转膜的电流是不是有点高哦，我以前用的是恒压，60V 2h的，300mA的电流应该高了，我很久没做了也记得不是很清楚。祝你好运
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35楼2014-05-15 09:24:54
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kingsa

木虫 (正式写手)
引用回帖:
34楼: Originally posted by 家平 at 2014-05-15 08:50:48
浓度高吗，调低试试
...

什么试剂浓度高了？5%脱脂奶粉吗？
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随心而动，如风自在
36楼2014-05-15 10:06:59
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kingsa

木虫 (正式写手)
引用回帖:
35楼: Originally posted by shaozhenjun at 2014-05-15 09:24:54
5%脱脂奶粉封闭步骤最好在摇床进行哈，你这个转膜的电流是不是有点高哦，我以前用的是恒压，60V 2h的，300mA的电流应该高了，我很久没做了也记得不是很清楚。祝你好运

封闭步骤我就是在摇床进行的。

转膜电流高了，是怕会转过头吗？我用了2层PVDF膜，接近胶的膜上marker条带清晰，另一膜上几乎没有条带。应该不会转过头吧？
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随心而动，如风自在
37楼2014-05-15 10:09:12
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家平

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
36楼: Originally posted by kingsa at 2014-05-15 10:06:59
什么试剂浓度高了？5%脱脂奶粉吗？...

对，有的蛋白要用3%奶粉封闭

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修身，齐家，治国，平天下
38楼2014-05-15 11:04:07
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dengming1983

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
34楼: Originally posted by 家平 at 2014-05-15 08:50:48
浓度高吗，调低试试
...

5%脱脂奶粉封闭的，一抗过夜也是在奶粉液里的。是不是一抗孵育不需要加奶粉？这些步骤之前是做出来过的哦
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39楼2014-05-15 17:00:03
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kingsa

木虫 (正式写手)
引用回帖:
39楼: Originally posted by dengming1983 at 2014-05-15 17:00:03
5%脱脂奶粉封闭的，一抗过夜也是在奶粉液里的。是不是一抗孵育不需要加奶粉？这些步骤之前是做出来过的哦...

一抗不是用TBST稀释吗？
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随心而动，如风自在
40楼2014-05-15 18:57:00
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