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kingsa

木虫 (正式写手)

内容已删除
随心而动,如风自在
31楼2014-05-14 09:25:20
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kingsa

木虫 (正式写手)

引用回帖:
31楼: Originally posted by kingsa at 2014-05-14 09:25:20
实验条件:
脑组织蛋白是上个月提取的,在-80℃冰箱保存差不多3周后,家裂解液冰浴超声裂解、BCA测浓度、加loading配制上样缓冲液、沸水浴变性,然后分装储存于-20℃冰箱。第二天开始WB实验。

目的蛋白18KD,β ...

以上是我实验条件和整个过程,求各位大神告诉我可能是哪步出了问题?

我昨天借了朋友的抗体,今天重新开工,看看是不是抗体的问题

各位大神,求指教啊!
随心而动,如风自在
32楼2014-05-14 09:27:54
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dengming1983

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
29楼: Originally posted by 家平 at 2014-05-14 08:42:14
你封闭的是不是有点厉害了
...

就是脱脂奶粉TBS液封闭一小时
33楼2014-05-15 06:11:37
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家平

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
33楼: Originally posted by dengming1983 at 2014-05-15 06:11:37
就是脱脂奶粉TBS液封闭一小时...

浓度高吗,调低试试

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修身,齐家,治国,平天下
34楼2014-05-15 08:50:48
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shaozhenjun

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

5%脱脂奶粉封闭步骤最好在摇床进行哈,你这个转膜的电流是不是有点高哦,我以前用的是恒压,60V 2h的,300mA的电流应该高了,我很久没做了也记得不是很清楚。祝你好运
35楼2014-05-15 09:24:54
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kingsa

木虫 (正式写手)

引用回帖:
34楼: Originally posted by 家平 at 2014-05-15 08:50:48
浓度高吗,调低试试
...

什么试剂浓度高了?5%脱脂奶粉吗?
随心而动,如风自在
36楼2014-05-15 10:06:59
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kingsa

木虫 (正式写手)

引用回帖:
35楼: Originally posted by shaozhenjun at 2014-05-15 09:24:54
5%脱脂奶粉封闭步骤最好在摇床进行哈,你这个转膜的电流是不是有点高哦,我以前用的是恒压,60V 2h的,300mA的电流应该高了,我很久没做了也记得不是很清楚。祝你好运

封闭步骤我就是在摇床进行的。

转膜电流高了,是怕会转过头吗?我用了2层PVDF膜,接近胶的膜上marker条带清晰,另一膜上几乎没有条带。应该不会转过头吧?
随心而动,如风自在
37楼2014-05-15 10:09:12
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家平

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
36楼: Originally posted by kingsa at 2014-05-15 10:06:59
什么试剂浓度高了?5%脱脂奶粉吗?...

对,有的蛋白要用3%奶粉封闭

[ 发自小木虫客户端 ]
修身,齐家,治国,平天下
38楼2014-05-15 11:04:07
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dengming1983

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
34楼: Originally posted by 家平 at 2014-05-15 08:50:48
浓度高吗,调低试试
...

5%脱脂奶粉封闭的,一抗过夜也是在奶粉液里的。是不是一抗孵育不需要加奶粉?这些步骤之前是做出来过的哦
39楼2014-05-15 17:00:03
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kingsa

木虫 (正式写手)

引用回帖:
39楼: Originally posted by dengming1983 at 2014-05-15 17:00:03
5%脱脂奶粉封闭的,一抗过夜也是在奶粉液里的。是不是一抗孵育不需要加奶粉?这些步骤之前是做出来过的哦...

一抗不是用TBST稀释吗?
随心而动,如风自在
40楼2014-05-15 18:57:00
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