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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » Western曝光后无条带，跪求指教！！！
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sunrq516516

金虫 (小有名气)
引用回帖:
20楼: Originally posted by kingsa at 2014-05-12 22:56:15
我明天中午去曝光。

今天转膜的时候，我放了两层膜，然后分步做染色。靠近胶的那张膜上marker条带很清晰，染色后的条带也很明显；另一张上只隐约有些条带，几乎是空白的。应该不会转膜过度吧。

我想今天应该 ...

两层膜……姑娘你好厉害这办法都想的出来。当年我学的时候，博后跟我说一般PVDF不会出现转膜过度的情况。所以你用PVDF膜就不用担心这个咧。
同是WB沦落人，GOOD LUCK TOMORROW!
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Permanent head Damage
21楼2014-05-12 21:05:38
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dengming1983

铁杆木虫 (著名写手)
哎，最近也是被Wb逼得要死，要赶紧搞完毕业了结果就是出不来目的条带。转膜后丽春红染色非常大的蛋白条带，曝光液也刚买了新的，就是没有条带出现，而且之前做两张膜，分别用旧的曝光液和新的曝光液分别曝光，新的显示内参了，旧的没有。所以更换新的曝光液，结果目的条带还是出不来。咋搞？今天加倍一抗过夜再看看，各位有啥高见的指导下
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22楼2014-05-12 21:15:30
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kingsa

木虫 (正式写手)
引用回帖:
21楼: Originally posted by sunrq516516 at 2014-05-12 21:05:38
两层膜……姑娘你好厉害这办法都想的出来。当年我学的时候，博后跟我说一般PVDF不会出现转膜过度的情况。所以你用PVDF膜就不用担心这个咧。
同是WB沦落人，GOOD LUCK TOMORROW!...

谢谢你的祝福，我也祈祷明天好运吧，再曝不出来我就要疯了！
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随心而动，如风自在
23楼2014-05-12 21:25:25
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kingsa

木虫 (正式写手)
引用回帖:
23楼: Originally posted by kingsa at 2014-05-12 21:25:25
谢谢你的祝福，我也祈祷明天好运吧，再曝不出来我就要疯了！
...

满怀希望去曝光，结果还是一样。泪崩……

曝光液是新买的，现用现配，曝光时间也增长到10min了。
难道抗体有问题吗？


求助啊！！！
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随心而动，如风自在
24楼2014-05-13 12:22:30
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lid2004

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

没想到WB还难倒这么多人。
1. 先查抗体：看厂家是不是有图，上样量多少。这个抗体有没有相关的文献
2. 最好带阳性对照，当然内参算一个阳性对照。但现在好多公司也卖抗原过表达的细胞裂解液，作为阳性对照。
3.你的目的条带比较小，18kd，电泳的时候注意电压别太大，时间可以适当减少，别跑过了。转膜时间不用过分延长。
4. 注意样品处理的问题，是不是加了酶抑制剂，是不是低温环境制备的，排除样品制备问题。你的样品检测过别的抗体没有，好用吗？
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25楼2014-05-13 14:34:06
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LZLLZLLZL

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

背景都没有啊，考虑一下二抗浓度，TBST洗膜的速度和时间。
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26楼2014-05-13 18:46:20
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treetreew

木虫 (小有名气)
重提个蛋白
多借几个1抗
不剪膜
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27楼2014-05-14 08:24:04
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家平

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

你孵二抗了吗？二抗对应不

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修身，齐家，治国，平天下
28楼2014-05-14 08:40:07
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家平

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
22楼: Originally posted by dengming1983 at 2014-05-12 21:15:30
哎，最近也是被Wb逼得要死，要赶紧搞完毕业了结果就是出不来目的条带。转膜后丽春红染色非常大的蛋白条带，曝光液也刚买了新的，就是没有条带出现，而且之前做两张膜，分别用旧的曝光液和新的曝光液分别曝光，新的显 ...

你封闭的是不是有点厉害了

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修身，齐家，治国，平天下
29楼2014-05-14 08:42:14
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shaozhenjun

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

转膜是半干转还是湿转，如果是湿转有没有采用冰袋降温，Marker一般很容易转上的，选用的是什么膜，PVDF or NC膜，孔径大小？蛋白封闭时间，抗体孵育时间？洗膜次数是否足够？显色液使用哪个厂家的？
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30楼2014-05-14 08:51:50
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