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kingsa

木虫 (正式写手)

[求助] Western曝光后无条带,跪求指教!!! 已有12人参与

最近几次Wetern Blot曝光后,发现只有膜的四周有些黑色,中间完全没有条带。
跪求各位大神指教!!!

曝光条带说明:
               前两条分别为12%和15%分离胶分离的目的条带,只有膜的四周有些黑色,中间完全没有条带
               后两条分别为12%和15%分离胶分离的β-actin条带;前者只有膜的四周有些黑色而中间完全没有条带,后者完全曝不出来


实验条件说明:
                 配胶试剂和marker应该没有问题,电泳液、电转液、TBST等试剂都是新配。
                 转膜之后,膜上的marker条带非常清晰,转膜应该没有问题的。
                 目的蛋白分子量为18KD,我剪的膜覆盖了marker  10-25 KD;β-actin分子量为43KD,我剪的膜覆盖了marker  35-55 KD
                 目的蛋白抗体购自Santa Cruz,给的稀释比例建议是100-1000,我用的是1:300(新配);β-actin和二抗按说明书稀释至1:5000
                 曝光时间从30s延长到10min,条带几乎没什么变化



跪求指教啊!!!

Western曝光后无条带,跪求指教!!!
marker.jpg


Western曝光后无条带,跪求指教!!!-1
曝光条带.jpg
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随心而动,如风自在
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qingyuansw20

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kingsa: 金币+5, ★★★很有帮助, 万分感谢 2014-05-11 20:15:37
按照以下方法开始排除吧:1、蛋白跑胶后,胶用卡马斯亮蓝染色,如没有上色问题出在跑胶的过程中或蛋有问题,蛋白检测含量,要是跑胶问题就自己查查文献。2、转膜后把膜和胶都考马斯亮蓝染色,看看有没有蛋白,要是纤维膜上有蛋白,说明转膜没问题。3、接下来就是抗体孵育了,本人建议直接作用actin,时间段,内参结果出得快,按内参说明书要求孵育(一般不会出问题)。4、曝光,定显影液需要全部新配置,曝光的时肉眼都能看得见发光。5、1.2步没问题,4步不出结果,3步换其它同学的内参,换了还不出结果4步有问题。自己摸索吧。6、内参要是出了,但是不出你的目标蛋白,赶紧买更贵的抗体吧。否则很难毕业了。
11楼2014-05-09 21:46:04
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

失败乃兵家常事,大侠请重新来过
2楼2014-05-09 08:40:51
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daibingling

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
是不是发光液有问题呢?内参应该很好出来的,而且转膜没问题的话,只能考虑后续的试剂和发光了。
3楼2014-05-09 08:57:27
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sunrq516516

金虫 (小有名气)

★ ★
youlinglyw: 金币+2, 感谢解答 2014-05-09 15:22:14
这个……WB确实是很看RP的事情……
你转膜之后有染一下膜看看没?转的有米有问题?有时候有Marker但不一定蛋白转的OK……
你actin的配比也是1:5000??会不会太稀了……以及虽然可能性比较小……但会不会是一抗不能识别你的sample的species?以前有跑出来过吗?
Permanent head Damage
4楼2014-05-09 09:01:03
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