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kingsa

木虫 (正式写手)

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[求助] Western曝光后无条带，跪求指教！！！已有12人参与

最近几次Wetern Blot曝光后，发现只有膜的四周有些黑色，中间完全没有条带。
跪求各位大神指教！！！

曝光条带说明：
            前两条分别为12%和15%分离胶分离的目的条带，只有膜的四周有些黑色，中间完全没有条带
            后两条分别为12%和15%分离胶分离的β-actin条带；前者只有膜的四周有些黑色而中间完全没有条带，后者完全曝不出来

实验条件说明：
               配胶试剂和marker应该没有问题，电泳液、电转液、TBST等试剂都是新配。
               转膜之后，膜上的marker条带非常清晰，转膜应该没有问题的。
               目的蛋白分子量为18KD，我剪的膜覆盖了marker  10-25 KD；β-actin分子量为43KD，我剪的膜覆盖了marker  35-55 KD
               目的蛋白抗体购自Santa Cruz，给的稀释比例建议是100-1000，我用的是1：300(新配)；β-actin和二抗按说明书稀释至1:5000
               曝光时间从30s延长到10min，条带几乎没什么变化

跪求指教啊！！！

marker.jpg

曝光条带.jpg

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随心而动，如风自在

1楼 2014-05-08 20:50:41

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qingyuansw20

金虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kingsa: 金币+5, ★★★很有帮助, 万分感谢 2014-05-11 20:15:37

按照以下方法开始排除吧：1、蛋白跑胶后，胶用卡马斯亮蓝染色，如没有上色问题出在跑胶的过程中或蛋有问题，蛋白检测含量，要是跑胶问题就自己查查文献。2、转膜后把膜和胶都考马斯亮蓝染色，看看有没有蛋白，要是纤维膜上有蛋白，说明转膜没问题。3、接下来就是抗体孵育了，本人建议直接作用actin，时间段，内参结果出得快，按内参说明书要求孵育（一般不会出问题）。4、曝光，定显影液需要全部新配置，曝光的时肉眼都能看得见发光。5、1.2步没问题，4步不出结果，3步换其它同学的内参，换了还不出结果4步有问题。自己摸索吧。6、内参要是出了，但是不出你的目标蛋白，赶紧买更贵的抗体吧。否则很难毕业了。