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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » 求助关于如何消除selex过程中非特异性序列的方法
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streptavidin

银虫 (初入文坛)

[求助] 求助关于如何消除selex过程中非特异性序列的方法 已有2人参与

各位大虾，我正在研究应用selex方法筛选hCG适体的课题。但是无法消除非特异性结合的序列，而且这些非特异性序列在全部ssDNA中占了大多数。
      我使用酶标板包被hCG，BSA封闭的方法，将ssDNA加入到酶标板上，结合过夜后，用washing buffer洗涤，然后用Urea洗脱，我使用了内标的方法来检测非特异性的序列是否已经洗脱完全，可是在电泳验证中内标条带始终出现。
      最近我也使用了很多的方法来消除非特异性的序列，包括增加洗涤次数，提高洗涤中离子强度等，都不能起到很好的效果。
      有没有去除非特异性序列具体的操作流程，操作细节。希望大虾们指导。
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1楼 2014-05-08 09:59:11
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-05-09 10:37:26
没有哪个SELEX是只做一轮的吧？
这样且不谈非特异性问题，就算是特异性的，也不是最优的
你把你洗脱下来的，想办法扩增一下，再跟配体再做结合
来个几轮，这样特异性结合的才会富集。
赞一下 回复此楼
2楼2014-05-08 21:41:05
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streptavidin

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-05-08 21:41:05
没有哪个SELEX是只做一轮的吧？
这样且不谈非特异性问题，就算是特异性的，也不是最优的
你把你洗脱下来的，想办法扩增一下，再跟配体再做结合
来个几轮，这样特异性结合的才会富集。

我可能没有描述清楚，我已经做了超过10轮了，在这样的情况下，非特异性还是占大多数，主要是与BSA的结合。我需要的是如何让特异性能够在所有单链DNA中占较高的比例。
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3楼2014-05-09 08:53:25
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streptavidin

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-05-08 21:41:05
没有哪个SELEX是只做一轮的吧？
这样且不谈非特异性问题，就算是特异性的，也不是最优的
你把你洗脱下来的，想办法扩增一下，再跟配体再做结合
来个几轮，这样特异性结合的才会富集。

谢谢你的帮助。
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4楼2014-05-09 08:53:44
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by streptavidin at 2014-05-09 08:53:25
我可能没有描述清楚，我已经做了超过10轮了，在这样的情况下，非特异性还是占大多数，主要是与BSA的结合。我需要的是如何让特异性能够在所有单链DNA中占较高的比例。...

你每轮之间DNA有扩增步骤的哦？
这样比较少见，10轮算正常，不太多，应该特异性有很大提高才对。
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5楼2014-05-09 11:00:13
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streptavidin

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-05-09 11:00:13
你每轮之间DNA有扩增步骤的哦？
这样比较少见，10轮算正常，不太多，应该特异性有很大提高才对。...

每轮筛选之后进行20轮PCR，我现在做到大概13轮左右，但是反筛效果不明显，结合BSA的序列明显比特异性的要多的多。
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6楼2014-05-09 13:03:41
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逍潇

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

不明白你为什么要用BSA封闭，ssDNA与酶标板结合能力应该不强。蛋白与酶标板之间是通过疏水相互作用结合的，ssDNA带负电，应该结合不上。
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7楼2014-12-15 20:54:27
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