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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » NADH氧化酶的测定问题
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connin

银虫 (小有名气)

[交流] NADH氧化酶的测定问题

近日要测定NADH氧化酶酶活，由于以前没测过，所以根据文献上的方法进行测定，如下：对数期细胞离心，用磷酸钾缓冲液（pH＝7洗一遍），超声，而后离心碎片去上清。500微升的反应体系：50mM的磷酸钾缓冲液（pH＝7），0.3mM的EDTA，0.3mM的NADH。而后加入10微升的合适浓度的样品，在340nm处测定吸光度的减少。
我按照上述方法进行测定，只是把磷酸钾溶液换成了Tris－HCL（ph＝7.8），但是发现吸光度没有变化，不知问题出在哪里，还望请教！
我第一次测酶活，有以下问题：
1是不是配溶液时都需无菌水
2NADH配好是不是要立即测，多长时间就失效了
3我的菌是革兰氏阳性菌（兽疫链球菌），超声一小时应该足够破碎了吧？
4测定酶活温度为30度，是不是温度对他的影响特别大，因为开始我想先试试，所以温度没有控制（主要我们实验室分光光度计没有温控装置，要去其它实验室用，麻烦），温度大概有20度，在此条件下测定没有变化。
希望大叫不吝赐教，我是新手，问题比较弱，希望大家给予支持！
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傻得可爱，可爱的傻
1楼 2008-03-12 09:19:09
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Airare

金虫 (正式写手)

虫游天下
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):xiexie 关注,.
connin(金币+5,VIP+0):xiexie
应该用去离子水，尽量排除水中杂质的影响，最好灭菌（又不难），消灭蛋白酶影响。
NADH在PH7.Tris7.5以上较稳定。当然是相对的，现用现配好。
超声太久也许会打断肽链。
温度各报道不同，不知道，条件要摸索一下。
最近也郁闷，测NADPH，不知道是不是所买试剂本身的问题。

[ Last edited by Airare on 2008-3-12 at 09:50 ]
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——穿越死亡之门，到我这里来，虽则梦想褪色，岁月集成的果实腐烂掉，但我是永恒的真理，你将再会见我，在你从此岸渡向彼岸的生命航程中...
2楼2008-03-12 09:49:14
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connin

银虫 (小有名气)
我的药品NADH是在sigma上买的，就是最常见的 贝塔－NADH钠盐，使用这个测吗？他的货号是N6005.有谁能告诉我一下啊
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傻得可爱，可爱的傻
3楼2008-03-18 10:14:48
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Airare

金虫 (正式写手)

虫游天下
reasonspare(金币+0,VIP+0):111楼主又发问了.请你再辛苦一下.
N6005
Sigma  β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate
≥94% (HPLC)   

这个吧，我用的是NADP，氧化型辅酶II，你用的是氧化型辅酶I了？
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4楼2008-03-18 18:49:26
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connin

银虫 (小有名气)
我用的是~95%的，对于用它测定NADH氧化酶的，应该没错吧
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傻得可爱，可爱的傻
5楼2008-03-18 22:11:59
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Airare

金虫 (正式写手)

虫游天下
测定NADH氧化酶，应该用还原型NADH，（不会弄错吧）测定340nm吸收值的减少（NADH减少），应该是呈线性，取线性最好的一段，其斜率代表活性；也可以用终点法，不必连续读数，但要摸好条件，就是反应时长。
NADH也许由于某些氧化因素不稳定，是不是买的分装的啊？对于进口分装的我吃过很大亏了
好运
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6楼2008-03-19 09:17:53
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HarveyWang

捐助贵宾 (知名作家)

海外行者

看我的

NADH可配制4-5mM的，浓度当然是大约，因为其纯度有问题，一般为90-95%。这要靠340nm吸光值测定来判断配好的浓度，其微摩尔吸光系数为0.00622.
NADH的配制溶液建议用10mM的Tris-HCl pH9.0以上的配，这样即使在4°C冰箱保存7天问题都不大。但是若用中性的双蒸水配制则很快导致其降解，即使在-20°C的低温下。

你的吸光值不下降可能有很多原因。需要你详细的操作过程。例如，你的加入的酶量过高，在此基础上调零后加NADH母液测定就超过了仪器的光检测极限。用双蒸水调零，酶液和NADH的总吸光值最好不要超过1.5.

另外建议你的缓冲液pH在8.0以上测定，可排出测定时NADH的自降解。
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【我一直认为做土匪很性感很坏，很直接，可以大声喊：JCMM我爱你！所以，我自从博士毕业后，就一直在寻找黑道大哥一起去抢钱、抢粮、抢地盘】
7楼2008-03-19 13:33:04
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connin

银虫 (小有名气)
详细步骤如下：
1  取对数期的细胞，因为的是发酵的粘多糖（透明质酸），需要进行稀释，用我配置的Tris－HCl（50mM ph为7.8），在12000g离心30min
2  再用一定量的Tris洗一遍，再离心
3  利用超声进行破碎，4s间歇，50min～1h
4  12000g离心碎片30min，取上清为粗酶液
5  酶反应体系：1ml     50mM Tris
                                0.3mM EDTA
                                0.3mM NADH
                                 20微升 粗酶液

结果：无变化。因为我是第一次测，因此菌体量跟酶量具体关系也不知，取样为5ml，菌体量约为2.7g/L

补充一点：以蒸馏水为对照，只加Tris和EDTA时，吸光度为0.013，加NADH后就变得很大，可能快1了，在加入粗酶液后就变为1.75了，是不是12000g离碎片没离完全啊，你赔NADH时是这样吗？

[ Last edited by connin on 2008-3-19 at 16:35 ]
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傻得可爱，可爱的傻
8楼2008-03-19 16:24:03
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