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NADH氧化酶的测定问题
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近日要测定NADH氧化酶酶活，由于以前没测过，所以根据文献上的方法进行测定，如下：对数期细胞离心，用磷酸钾缓冲液（pH＝7洗一遍），超声，而后离心碎片去上清。500微升的反应体系：50mM的磷酸钾缓冲液（pH＝7），0.3mM的EDTA，0.3mM的NADH。而后加入10微升的合适浓度的样品，在340nm处测定吸光度的减少。 我按照上述方法进行测定，只是把磷酸钾溶液换成了Tris－HCL（ph＝7.8），但是发现吸光度没有变化，不知问题出在哪里，还望请教！ 我第一次测酶活，有以下问题： 1是不是配溶液时都需无菌水 2NADH配好是不是要立即测，多长时间就失效了 3我的菌是革兰氏阳性菌（兽疫链球菌），超声一小时应该足够破碎了吧？ 4测定酶活温度为30度，是不是温度对他的影响特别大，因为开始我想先试试，所以温度没有控制（主要我们实验室分光光度计没有温控装置，要去其它实验室用，麻烦），温度大概有20度，在此条件下测定没有变化。 希望大叫不吝赐教，我是新手，问题比较弱，希望大家给予支持！  |
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NADH可配制4-5mM的，浓度当然是大约，因为其纯度有问题，一般为90-95%。这要靠340nm吸光值测定来判断配好的浓度，其微摩尔吸光系数为0.00622. NADH的配制溶液建议用10mM的Tris-HCl pH9.0以上的配，这样即使在4°C冰箱保存7天问题都不大。但是若用中性的双蒸水配制则很快导致其降解，即使在-20°C的低温下。 你的吸光值不下降可能有很多原因。需要你详细的操作过程。例如，你的加入的酶量过高，在此基础上调零后加NADH母液测定就超过了仪器的光检测极限。用双蒸水调零，酶液和NADH的总吸光值最好不要超过1.5. 另外建议你的缓冲液pH在8.0以上测定，可排出测定时NADH的自降解。 |
7楼2008-03-19 13:33:04
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详细步骤如下： 1 取对数期的细胞，因为的是发酵的粘多糖（透明质酸），需要进行稀释，用我配置的Tris－HCl（50mM ph为7.8），在12000g离心30min 2 再用一定量的Tris洗一遍，再离心 3 利用超声进行破碎，4s间歇，50min～1h 4 12000g离心碎片30min，取上清为粗酶液 5 酶反应体系：1ml 50mM Tris 0.3mM EDTA 0.3mM NADH 20微升 粗酶液 结果：无变化。因为我是第一次测，因此菌体量跟酶量具体关系也不知，取样为5ml，菌体量约为2.7g/L 补充一点：以蒸馏水为对照，只加Tris和EDTA时，吸光度为0.013，加NADH后就变得很大，可能快1了，在加入粗酶液后就变为1.75了，是不是12000g离碎片没离完全啊，你赔NADH时是这样吗？ [ Last edited by connin on 2008-3-19 at 16:35 ] |
8楼2008-03-19 16:24:03
