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NADH氧化酶的测定问题
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近日要测定NADH氧化酶酶活，由于以前没测过，所以根据文献上的方法进行测定，如下：对数期细胞离心，用磷酸钾缓冲液（pH＝7洗一遍），超声，而后离心碎片去上清。500微升的反应体系：50mM的磷酸钾缓冲液（pH＝7），0.3mM的EDTA，0.3mM的NADH。而后加入10微升的合适浓度的样品，在340nm处测定吸光度的减少。 我按照上述方法进行测定，只是把磷酸钾溶液换成了Tris－HCL（ph＝7.8），但是发现吸光度没有变化，不知问题出在哪里，还望请教！ 我第一次测酶活，有以下问题： 1是不是配溶液时都需无菌水 2NADH配好是不是要立即测，多长时间就失效了 3我的菌是革兰氏阳性菌（兽疫链球菌），超声一小时应该足够破碎了吧？ 4测定酶活温度为30度，是不是温度对他的影响特别大，因为开始我想先试试，所以温度没有控制（主要我们实验室分光光度计没有温控装置，要去其它实验室用，麻烦），温度大概有20度，在此条件下测定没有变化。 希望大叫不吝赐教，我是新手，问题比较弱，希望大家给予支持！  |
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