| 查看: 831 | 回复: 7 | |||
| 当前主题已经存档。 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
[交流]
NADH氧化酶的测定问题
|
|||
|
近日要测定NADH氧化酶酶活，由于以前没测过，所以根据文献上的方法进行测定，如下：对数期细胞离心，用磷酸钾缓冲液（pH＝7洗一遍），超声，而后离心碎片去上清。500微升的反应体系：50mM的磷酸钾缓冲液（pH＝7），0.3mM的EDTA，0.3mM的NADH。而后加入10微升的合适浓度的样品，在340nm处测定吸光度的减少。 我按照上述方法进行测定，只是把磷酸钾溶液换成了Tris－HCL（ph＝7.8），但是发现吸光度没有变化，不知问题出在哪里，还望请教！ 我第一次测酶活，有以下问题： 1是不是配溶液时都需无菌水 2NADH配好是不是要立即测，多长时间就失效了 3我的菌是革兰氏阳性菌（兽疫链球菌），超声一小时应该足够破碎了吧？ 4测定酶活温度为30度，是不是温度对他的影响特别大，因为开始我想先试试，所以温度没有控制（主要我们实验室分光光度计没有温控装置，要去其它实验室用，麻烦），温度大概有20度，在此条件下测定没有变化。 希望大叫不吝赐教，我是新手，问题比较弱，希望大家给予支持！  |
回复此楼» 猜你喜欢
求推荐博导
已经有4人回复
-
拟解决的关键科学问题还要不要写
已经有8人回复
-
为什么nbs上溴 没有产物点出现呢
已经有5人回复
-
存款400万可以在学校里躺平吗
已经有34人回复
-
求助一下有机合成大神
已经有4人回复
-
最失望的一年
已经有16人回复
-
求推荐英文EI期刊
已经有5人回复
-
26申博
已经有3人回复
-
基金委咋了？2026年的指南还没有出来？
已经有10人回复
-
疑惑？
已经有5人回复
|
详细步骤如下： 1 取对数期的细胞，因为的是发酵的粘多糖（透明质酸），需要进行稀释，用我配置的Tris－HCl（50mM ph为7.8），在12000g离心30min 2 再用一定量的Tris洗一遍，再离心 3 利用超声进行破碎，4s间歇，50min～1h 4 12000g离心碎片30min，取上清为粗酶液 5 酶反应体系：1ml 50mM Tris 0.3mM EDTA 0.3mM NADH 20微升 粗酶液 结果：无变化。因为我是第一次测，因此菌体量跟酶量具体关系也不知，取样为5ml，菌体量约为2.7g/L 补充一点：以蒸馏水为对照，只加Tris和EDTA时，吸光度为0.013，加NADH后就变得很大，可能快1了，在加入粗酶液后就变为1.75了，是不是12000g离碎片没离完全啊，你赔NADH时是这样吗？ [ Last edited by connin on 2008-3-19 at 16:35 ] |
8楼2008-03-19 16:24:03
Airare
金虫 (正式写手)
虫游天下
- 应助: 2 (幼儿园)
- 金币: 1409.2
- 散金: 56
- 红花: 1
- 帖子: 667
- 在线: 52.5小时
- 虫号: 442605
- 注册: 2007-10-27
- 专业: 细胞信号转导
2楼2008-03-12 09:49:14
3楼2008-03-18 10:14:48
Airare
金虫 (正式写手)
虫游天下
- 应助: 2 (幼儿园)
- 金币: 1409.2
- 散金: 56
- 红花: 1
- 帖子: 667
- 在线: 52.5小时
- 虫号: 442605
- 注册: 2007-10-27
- 专业: 细胞信号转导
4楼2008-03-18 18:49:26