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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » 170kDa膜蛋白MRP1跑WB遇到问题
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yyc12596

新虫 (著名写手)

[交流] 170kDa膜蛋白MRP1跑WB遇到问题已有7人参与

需要做一个膜蛋白，MRP1，分子量170kDa.
       WB一直遇到问题，没有拿到自己的目的条带。
     
     使用了Thermo的膜蛋白提取试剂盒，细胞裂解和离心都是在冰上或者四度进行的。膜蛋白和胞浆蛋白在-20度冻存。

     因为膜蛋白100度煮沸5分钟据说会沉淀，所以样本解冻之后1:1加lamaelli（5%2-ME）loading buffer，37度温育30分钟，然后直接上样。BIO-RAD的4-15%的胶。
     之后恒压100V,湿转2小时。中间换一次冰盒。电流从0.3A会增高到0.45A.

        封闭，一抗，二抗，显影。
     标本用了人THP-1细胞株（未用PMA分化），以及人血来源的巨噬细胞（M-CSF分化）。

     一抗用了R&D的MRP1(QCRL,MAB19291),Abcam的MRP1(IU2H10，识别MRP1的1-33aa)。两支抗体孵育出的条带都在55kDa大小！
     下图是Abcam一抗孵育之后。
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1楼2014-04-30 03:38:14
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yyc12596

新虫 (著名写手)
1% benzonase的作用：

Benzonase® endonuclease has been especially designed for applications in biotechnological processing, such as:
• removing DNA/RNA from proteins and other biologicals
• reducing viscosity caused by nucleic acids
• preparing samples in electrophoresis and chromatography
• preventing cell clumping

这一步可能是关键步骤吗？也许需要买一下这个酶，加到样本里去。
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5楼2014-04-30 04:00:07
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yyc12596

新虫 (著名写手)
lysis buffer:

1% SDS (1% SDS in TBS with 5 mM IAA, 0.5 mM PMSF, 1X PIC and 1% benzonase)

lysis for 30 minutes at room temperature
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9楼2014-05-02 05:23:34
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yyc12596

新虫 (著名写手)
5 mM IAA应该是吲哚乙酸（indole-3-acetic acid），但是裂解细胞的时候加它干嘛？？完全不能理解啊。
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10楼2014-05-02 05:28:51
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yyc12596

新虫 (著名写手)
FACS问题解决方案：
1.怀疑透膜和固定不够。之前用了eBioscience的固定剂4度过夜，然后用它的透膜剂。现在准备试试4%PFA固定，0.3%TritonX100透膜，然后染直标抗体看看。间标抗体上次阳性，现在拿来做阳性对照。

2.怀疑BD的抗体有问题。不过BD的流式抗体一直很好用，现在买的直标抗体确实是抗人的，FITC通道，过期时间是明年。各方面看起来都正常。所以，对抗体的怀疑会放到最后，先验证其他问题。

3.细胞株有问题。WB和荧光染色都没问题，所以基本不存在细胞株本身没有这个蛋白的问题。

做实验老遇到这种无聊的原因，想着根本不可能做不出来的时候，偏偏会出点问题做不出来。
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24楼2014-07-03 03:47:11
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yyc12596

新虫 (著名写手)
引用回帖:
28楼: Originally posted by carolyn_cat at 2016-06-16 20:32:59
楼主，您好，看到您的帖子发现您做的蛋白和我的和相似，我现在做WB卡在了您之前样品降解的情况那，我想请问您成功的经验。想请教一下您是用什么裂解液的？您上面写的“ Laemmli sample buffer，37度30分钟裂解，再 ...

是的。就是BIO-RAD公司买的那种loading  buffer, 直接拿来裂解细胞了。

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carolyn_cat
29楼2016-06-17 09:32:27
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yyc12596

新虫 (著名写手)
小木虫貌似上传图片很困难。那就不传图片了。反正现在的问题就是本该在170KDA处的条带一直没有，但是55KDA处每次都出现一条特异性条带。

   转膜用的是0.45um的PVDF膜。

    Abcam公司的抗体WB图，以及其他文献用的ENZO家的MRPr1抗体孵育出来的带都很漂亮，位置也对。

    原因何在？求经验！
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2楼2014-04-30 03:43:06
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yyc12596

新虫 (著名写手)
文献上的方法：
Latency-Associated Degradation of the MRP1 Drug Transporter During Latent Human Cytomegalovirus Infection
Michael P. Weekes, Shireen Y. L. Tan, Emma Poole, Suzanne Talbot, Robin Antrobus, Duncan L. Smith, Christina Montag, Steven P. Gygi, John H. Sinclair, Paul J. Lehner*
*Corresponding author. E-mail pjl30@cam.ac.uk
Published 12 April 2013, Science 340, 199 (2013)

Primary antibodies used for immunoblotting were: MRPr1 α-MRP1 (Enzo Life Sciences)

Immunoblotting ：
For immunoblots, cells were lysed in SDS sample buffer in TBS with 1% benzonase. Lysates were heated for 30 min at 37°C, separated by SDS/PAGE (UL138 -12% polyacrylamide gel; MRP1 - 7% polyacrylamide gel) and transferred to PVDF membranes (Millipore). For MRP1, membranes were denatured with 6M guanidinium chloride. Reactive bands were detected by SuperSignal West Pico or Dura substrates (Thermo).
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3楼2014-04-30 03:46:21
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yyc12596

新虫 (著名写手)
现在怀疑目标蛋白是不是被降解了？55KDA的条带让人很不舒坦。
    上样：
    2x Laemmli Sample Buffer #161-0737

Dilute protein samples 1:1 in 2x Laemmli sample buffer before loading on SDS-PAGE gels (requires the addition of β-mercaptoethanol).
•Formulation: 65.8 mM Tris-HCl, pH 6.8, 2.1% SDS, 26.3% (w/v) glycerol, 0.01% bromophenol blue
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4楼2014-04-30 03:51:57
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yyc12596

新虫 (著名写手)
For MRP1, membranes were denatured with 6M guanidinium chloride.

这一步以前从来没用过。这是指转完膜之后，封闭之前先用盐酸胍把膜变性吗？原因又是什么呢。

关于盐酸胍在WB中的作用。
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6楼2014-04-30 04:07:08
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yyc12596

新虫 (著名写手)
找到一段盐酸胍洗脱PVDF膜的说明：

一般stripping的原理都是利用蛋白变性以及利用beta-mercaptoethanol打开-s-s-，使一二抗解聚变性而被洗去，但洗脱的强度是一个关键，小了抗体洗不干净影响re-probe，大了又造成抗原的损失

1、比较老的方法（需要50℃温浴）
Stripping Buffer:β-mercaptoethanol 342 μl；20% SDS 5 ml；1MTris-Cl pH 6.7 3.125 ml；加ddH2O至50 ml。

方法：将用过的膜浸入stripping buffer中，置50℃水浴箱中30min，间断振摇。之后用TTBS洗5min/次洗到无beta-mercaptoethanol的味道就好。此时你已经可以按新的转移好的膜来再次使用了。

2、结合盐酸胍的方法（仅适用PVDF，但这种方法抗原损失少，抗体洗脱也比较干净，我们比较过后也一直在使用）

Stripping Buffer：50mM Glycine-NaOH(pH10.8), 7M Guanidine hydrochloride, 100mM KCl, 0.2mM EDTA, add 22.5uL beta-Mercaptoethanol/10mL stripping buffer just before use.

1) After ECL development, wash membrane once for 10min with TBST/PBST.

2) Incubate the membrane in stripping buffer in a shake for 6-8min at RT.

3) Washed stripped membrane at least 3x for 8min each with TBST/PBST, then re-block.

这种方法stripping buffer可以重复利用2次，用时也较快，当然基于盐酸胍的配方还有很多。
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7楼2014-05-01 06:41:19
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yyc12596

新虫 (著名写手)
根据我的理解，上文这段用盐酸胍是把已经显色过的（一抗二抗）早就孵育过的膜，重新洗脱（保留抗原），使膜完好如初，可以重新孵育其他的一抗。

    我昨天试过用8M Urea室温5分钟洗脱已显色过的膜，TBST洗三遍，然后重新封闭，一抗孵育过夜，二抗室温一小时。今天显色，还是没有目的条带，还是55kda地方的那条带而已。

    6M盐酸胍和8M Urea都可以使蛋白变性。因为暂时没有盐酸胍，所以拿Urea做了一下尝试，还是不行。

    不知道问题到底出在哪里了！
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8楼2014-05-01 06:50:57
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