24小时热门版块排行榜    

北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
查看: 4236  |  回复: 39

yyc12596

新虫 (著名写手)

引用回帖:
30楼: Originally posted by carolyn_cat at 2016-06-17 09:51:47
您好,请问您是加多少裂解液进去裂解细胞?您上面说的“37度30分钟裂解,再50度20分钟加热”,是指刮了细胞收集到ep管后37度再裂解30分钟吗?这样子蛋白不会降解吗?非常感谢您!...

我当时是:100ul  2xLaemmli sample buffer(2xloadingbuffer不加任何试剂稀释,不要加2-ME还原剂, 但是可以加cocktail等蛋白酶抑制剂)直接加到1x10-6细胞里(6孔板)中,勉强可以覆盖板底。
   最开始用的是37度30分钟裂解(6孔板中),然后把裂解后的细胞刮下来,放到EP管中,再50度20分钟加热。
   
    后来做熟悉了之后,改为:冰上30分钟裂解(6孔板中),然后把裂解后的细胞刮下来,放到EP管中,再100度7分钟煮沸,冷却后直接上样跑WB,或者冻存。条带很漂亮。

    因此,这一步骤的关键因素是:用SDS裂解细胞(Laemmli 是SDS为主的裂解液),才可以看见MRP1蛋白的WB条带。
    我自己后来试过配制1%SDS裂解液,1%Triton X100裂解液,1%NP40裂解液,结果:SDS可见MRP1条带,Triton X100可见模糊MRP1条带,NP40无MRP1条带。但是自己配制的1%SDS裂解液条带不及2xLaemmli sample buffer漂亮,所以还是用公司的。

    PS:MRP1蛋白WB, 除了裂解液重要,抗体也重要。就这两步关键,其他步骤正常操作就可以。

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

31楼2016-06-17 17:04:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

carolyn_cat

新虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
送红花一朵
引用回帖:
31楼: Originally posted by yyc12596 at 2016-06-17 17:04:33
我当时是:100ul  2xLaemmli sample buffer(2xloadingbuffer不加任何试剂稀释,不要加2-ME还原剂, 但是可以加cocktail等蛋白酶抑制剂)直接加到1x10-6细胞里(6孔板)中,勉强可以覆盖板底。
   最开始用的是37度 ...

楼主,您好,我按照您的方法进行了实验,真的跑出了我的条带,我想再请教您您是怎么进行蛋白定量的?
32楼2016-07-31 15:02:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

harry007

新虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
我跟楼主遇到的问题是一样一样滴

发自小木虫IOS客户端
33楼2016-08-01 22:23:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yyc12596

新虫 (著名写手)

引用回帖:
32楼: Originally posted by carolyn_cat at 2016-07-31 15:02:45
楼主,您好,我按照您的方法进行了实验,真的跑出了我的条带,我想再请教您您是怎么进行蛋白定量的?...

nano检测。

发自小木虫IOS客户端

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

34楼2016-08-02 10:22:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

carolyn_cat

新虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
送红花一朵
引用回帖:
34楼: Originally posted by yyc12596 at 2016-08-02 10:22:04
nano检测。
...

好的,明白。谢谢楼主的帮助!
35楼2016-08-09 10:07:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zx875987652

新虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
17楼: Originally posted by yyc12596 at 2014-05-03 04:23:35
终于看到目标蛋白了!

     排除各种条件,细胞裂解液的成分是最关键的。

      Laemmli sample buffer,37度30分钟裂解,再50度20分钟加热,40v湿转过夜,PBST洗涤,条带就出来了!

      接下来就是设计 ...

请教您下,您最后做出来的转膜条件是什么?转膜缓冲液中有没有加甲醇和SDS?我在做膜蛋白VEGFR2,一直没做出来

发自小木虫IOS客户端
36楼2016-12-02 17:34:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zx875987652

新虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
31楼: Originally posted by yyc12596 at 2016-06-17 17:04:33
我当时是:100ul  2xLaemmli sample buffer(2xloadingbuffer不加任何试剂稀释,不要加2-ME还原剂, 但是可以加cocktail等蛋白酶抑制剂)直接加到1x10-6细胞里(6孔板)中,勉强可以覆盖板底。
   最开始用的是37度 ...

楼主,你好!你用的转膜条件跟转膜缓冲液是怎么样的?缓冲液有加甲醇跟SDS吗?我在做vegfr2,摸了几次条件都做不出来,正打算按照楼主的方法提蛋白试试~谢谢

发自小木虫IOS客户端
37楼2016-12-02 18:32:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

忘我的我

木虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
37楼: Originally posted by zx875987652 at 2016-12-02 18:32:05
楼主,你好!你用的转膜条件跟转膜缓冲液是怎么样的?缓冲液有加甲醇跟SDS吗?我在做vegfr2,摸了几次条件都做不出来,正打算按照楼主的方法提蛋白试试~谢谢
...

你好,最后你得VEGFR2是怎么跑出来的呢?具体条件如何,麻烦告知一下,谢谢
向着春暖花开的远方流浪
38楼2020-07-21 22:36:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

忘我的我

木虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
楼主,你好。我最近也在跑一个分子量180kDa左右的膜蛋白,用的细胞,试过加大上样量、煮沸或者不煮蛋白样品跑不出来,用过赛默飞的RIPA裂解液,也试过英文特的膜蛋白提取试剂盒,效果都不好。我请教你,你在六孔板里加2×laemmli sample buffer冰上裂解30分钟后把细胞刮到EP管之后还离心吗?离心条件是什么?这个跟SDS loading buffer有什么区别?100℃加热前还要加SDS loading buffe吗?问题比较碎,麻烦你了
向着春暖花开的远方流浪
39楼2020-07-21 23:01:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

匿名

用户注销 (著名写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
本帖仅楼主可见
40楼2020-07-22 08:50:41
已阅   申请BioEPI   回复此楼   编辑   查看我的主页
相关版块跳转 我要订阅楼主 yyc12596 的主题更新
普通表情 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 086000生物与医药求调剂 +3 老天眷顾之人 2026-03-31 3/150 2026-04-05 22:24 by syh9288
[考研] 材料专硕322分 +10 哈哈哈吼吼吼哈 2026-04-04 10/500 2026-04-05 21:22 by 学员8dgXkO
[考研] 材料专硕283求调剂 +14 试试看呗 2026-04-04 15/750 2026-04-05 19:21 by jkddd
[考研] 308求调剂 +4 maverick^_^ 2026-04-03 4/200 2026-04-05 19:08 by 蓝云思雨
[考研] 0703化学321分求调剂 +17 三dd. 2026-03-30 18/900 2026-04-05 18:07 by 蓝云思雨
[考研] 285求调剂 +11 哦呦呼o 2026-04-04 11/550 2026-04-05 17:59 by 猪会飞
[考研] 材料求调剂 +10 呢呢妮妮 2026-04-01 10/500 2026-04-04 23:12 by 无际的草原
[考研] 286求调剂 +3 草木不言 2026-04-04 3/150 2026-04-04 22:40 by lbsjt
[考研] 0854求调剂 +4 assdll 2026-04-03 4/200 2026-04-04 22:17 by hemengdong
[考研] 301求调剂 +18 骆驼男人 2026-04-02 18/900 2026-04-04 20:33 by 蓝云思雨
[考研] 368求调剂 +5 今华习 2026-04-03 7/350 2026-04-04 18:47 by imissbao
[考研] 材料科学与工程考研 +10 拯救皮特托先生 2026-04-02 10/500 2026-04-03 23:57 by userper
[考研] 求调剂22408 288分 +5 new382 2026-04-02 5/250 2026-04-03 09:13 by 醉在风里
[考研] 调剂 +3 osbbx 2026-04-02 3/150 2026-04-03 07:47 by cc8418
[考研] 交通运输考试264分求工科调剂 +4 jike777 2026-04-02 4/200 2026-04-02 21:53 by zllcz
[考研] 279求调剂 +5 傅文秋 2026-04-02 5/250 2026-04-02 18:10 by 笔落锦州
[考研] 275学硕081000服从调剂到其他专业,保不住本专业了 +7 一只小小水牛 2026-04-02 8/400 2026-04-02 14:23 by alice-2022
[考研] 302求调剂一志愿北航070300,本科郑大化学 +8 圣日耳曼条 2026-04-01 11/550 2026-04-02 07:40 by chemdavid
[考研] 304求调剂 +12 素年祭语 2026-03-31 15/750 2026-04-01 22:41 by peike
[考研] 求调剂0703 +5 周嘉尧 2026-03-31 8/400 2026-04-01 20:32 by ltltkkk
信息提示
请填处理意见