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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » 170kDa膜蛋白MRP1跑WB遇到问题
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yyc12596

新虫 (著名写手)
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30楼: Originally posted by carolyn_cat at 2016-06-17 09:51:47
您好，请问您是加多少裂解液进去裂解细胞？您上面说的“37度30分钟裂解，再50度20分钟加热”，是指刮了细胞收集到ep管后37度再裂解30分钟吗？这样子蛋白不会降解吗？非常感谢您！...

我当时是：100ul  2xLaemmli sample buffer（2xloadingbuffer不加任何试剂稀释，不要加2-ME还原剂, 但是可以加cocktail等蛋白酶抑制剂）直接加到1x10-6细胞里（6孔板）中，勉强可以覆盖板底。
   最开始用的是37度30分钟裂解（6孔板中），然后把裂解后的细胞刮下来，放到EP管中，再50度20分钟加热。
   
    后来做熟悉了之后，改为：冰上30分钟裂解（6孔板中），然后把裂解后的细胞刮下来，放到EP管中，再100度7分钟煮沸，冷却后直接上样跑WB,或者冻存。条带很漂亮。

    因此，这一步骤的关键因素是：用SDS裂解细胞（Laemmli 是SDS为主的裂解液），才可以看见MRP1蛋白的WB条带。
    我自己后来试过配制1%SDS裂解液，1%Triton X100裂解液，1%NP40裂解液，结果：SDS可见MRP1条带，Triton X100可见模糊MRP1条带，NP40无MRP1条带。但是自己配制的1%SDS裂解液条带不及2xLaemmli sample buffer漂亮，所以还是用公司的。

    PS:MRP1蛋白WB, 除了裂解液重要，抗体也重要。就这两步关键，其他步骤正常操作就可以。
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carolyn_cat
31楼2016-06-17 17:04:33
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carolyn_cat

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31楼: Originally posted by yyc12596 at 2016-06-17 17:04:33
我当时是：100ul  2xLaemmli sample buffer（2xloadingbuffer不加任何试剂稀释，不要加2-ME还原剂, 但是可以加cocktail等蛋白酶抑制剂）直接加到1x10-6细胞里（6孔板）中，勉强可以覆盖板底。
   最开始用的是37度 ...

楼主，您好，我按照您的方法进行了实验，真的跑出了我的条带，我想再请教您您是怎么进行蛋白定量的？
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32楼2016-07-31 15:02:45
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harry007

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我跟楼主遇到的问题是一样一样滴

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33楼2016-08-01 22:23:38
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yyc12596

新虫 (著名写手)
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32楼: Originally posted by carolyn_cat at 2016-07-31 15:02:45
楼主，您好，我按照您的方法进行了实验，真的跑出了我的条带，我想再请教您您是怎么进行蛋白定量的？...

nano检测。

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carolyn_cat
34楼2016-08-02 10:22:04
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carolyn_cat

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34楼: Originally posted by yyc12596 at 2016-08-02 10:22:04
nano检测。
...

好的，明白。谢谢楼主的帮助！
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35楼2016-08-09 10:07:47
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zx875987652

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17楼: Originally posted by yyc12596 at 2014-05-03 04:23:35
终于看到目标蛋白了！

     排除各种条件，细胞裂解液的成分是最关键的。

      Laemmli sample buffer，37度30分钟裂解，再50度20分钟加热，40v湿转过夜，PBST洗涤，条带就出来了！

      接下来就是设计 ...

请教您下，您最后做出来的转膜条件是什么？转膜缓冲液中有没有加甲醇和SDS？我在做膜蛋白VEGFR2，一直没做出来

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36楼2016-12-02 17:34:10
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zx875987652

新虫 (初入文坛)
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31楼: Originally posted by yyc12596 at 2016-06-17 17:04:33
我当时是：100ul  2xLaemmli sample buffer（2xloadingbuffer不加任何试剂稀释，不要加2-ME还原剂, 但是可以加cocktail等蛋白酶抑制剂）直接加到1x10-6细胞里（6孔板）中，勉强可以覆盖板底。
   最开始用的是37度 ...

楼主，你好！你用的转膜条件跟转膜缓冲液是怎么样的？缓冲液有加甲醇跟SDS吗？我在做vegfr2，摸了几次条件都做不出来，正打算按照楼主的方法提蛋白试试～谢谢

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37楼2016-12-02 18:32:05
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忘我的我

木虫 (正式写手)
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37楼: Originally posted by zx875987652 at 2016-12-02 18:32:05
楼主，你好！你用的转膜条件跟转膜缓冲液是怎么样的？缓冲液有加甲醇跟SDS吗？我在做vegfr2，摸了几次条件都做不出来，正打算按照楼主的方法提蛋白试试～谢谢
...

你好，最后你得VEGFR2是怎么跑出来的呢？具体条件如何，麻烦告知一下，谢谢
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向着春暖花开的远方流浪
38楼2020-07-21 22:36:47
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忘我的我

木虫 (正式写手)
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楼主，你好。我最近也在跑一个分子量180kDa左右的膜蛋白，用的细胞，试过加大上样量、煮沸或者不煮蛋白样品跑不出来，用过赛默飞的RIPA裂解液，也试过英文特的膜蛋白提取试剂盒，效果都不好。我请教你，你在六孔板里加2×laemmli sample buffer冰上裂解30分钟后把细胞刮到EP管之后还离心吗？离心条件是什么？这个跟SDS loading buffer有什么区别？100℃加热前还要加SDS loading buffe吗？问题比较碎，麻烦你了
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向着春暖花开的远方流浪
39楼2020-07-21 23:01:51
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匿名

用户注销 (著名写手)
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40楼2020-07-22 08:50:41
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