24小时热门版块排行榜    

CyRhmU.jpeg
查看: 4010  |  回复: 39

yyc12596

新虫 (著名写手)

蛋白酶抑制剂混合液(100×PIC)  


蛋白酶抑制剂(Protease Inhibitor)指与蛋白酶分子活性中心上的一些基团结合,使蛋白酶活力下降,
甚至消失,但不使酶蛋白变性的物质。蛋白酶抑制剂有很多种,包括EDTA、E-64、NaVO3、Bestatin、Leupetin、Pepstatin A、Aprotinin等,可以有效抑制蛋白的降解,并维持原有的蛋白间相互作用。  

蛋白酶抑制剂混合液(100×PIC)主要由Leupetin、Pepstatin A、 Aprotinin、E-64等组成,不含
EDTA。该混合物可以抑制绝大多数蛋白酶活性,包括丝氨酸蛋白酶、半胱胺酸蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等。该蛋白酶抑制剂混合液是100×的浓缩的DMSO溶液,适用于从哺乳动物组织、细胞中提取蛋白质,能够更有效的获得目的蛋白质。提取出来的蛋白可以用于Western Blot、免疫共沉淀等试验。
11楼2014-05-02 05:35:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yyc12596

新虫 (著名写手)

在网上搜到的类似疑问:

当我们制作细胞裂解液的时候,会丢失大部分的膜蛋白,有的是降解了有的是没办法收集,因此当我们用细胞裂解液做CD系列蛋白WB的时候很难做出来。一般用流式细胞和免疫银光检测比较容易出结果。
        在此我就想请问高手,如何在制作细胞裂解也的时候更好的保护膜蛋白,让它的损失尽可能的少,有人会叫我用膜蛋白提取试剂盒,我们试过效果还是不好。我们甚至试过用buffer直接煮细胞上样、buffer超声细胞离心上样、冰浴裂解,都试过,现在就是要考虑一下、裂解液的盐浓度是否与它有关。
12楼2014-05-02 05:53:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yyc12596

新虫 (著名写手)

一直在用的细胞裂解液配方:

25mM tris
150mM NaCl
1mM EDTA
1% NP-40
5% glycerol
13楼2014-05-02 07:53:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yyc12596

新虫 (著名写手)

关于细胞裂解时几种去垢剂的作用:

SDS ,NP-40 ,TritonX-100这三种去垢剂的作用是不同的,或者说作用力量强弱不同。

SDS属于离子型去垢剂,最厉害,基本可以把细胞完全破掉,DNA会释放出来,裂解液变得很粘稠。

NP-40是很温和的去垢剂,1%浓度的基本可以破坏掉胞膜,而对核膜破坏的作用弱,结合特定的buffer可以获得胞浆蛋白。

TritonX-100的能力介于NP40和SDS之间,偏向于NP40,也是常用的细胞裂解液成分之一,在保护蛋白活性方面有一定作用(SDS基本会使蛋白变性失活)。
14楼2014-05-02 07:57:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yyc12596

新虫 (著名写手)

在蛋白裂解液中EDTA是螯合游离的金属离子的作用,达到降低金属蛋白酶的效果,减少蛋白的降解。

胰酶中的EDTA主要是螯合细胞表面或培养液中的游离的二价的金属离子,减少金属离子对胰酶的抑制作用,但其对细胞贴壁有影响,如果细胞容易消化,可不加EDTA。

EDTA是一种螯合剂,它可以螯合Ca2+或Mg2+,而细胞表面很多和培养皿或培养瓶结合的蛋白都是带有Ca2+或Mg2+的,把这些离子螯合后,可以加速细胞和培养皿的脱离,促进消化.EDTA是2价阳离子螯合剂,所以能螯合钙、镁等离子。上皮类细胞的连接存在“桥粒”结构,是细胞间最“牢固”的连接,但桥粒的形成依赖于钙离子的存在。在胰酶消化细胞时,加入EDTA,可以破坏细胞的桥粒结构,使细胞能够分散成单个细胞。通俗地说,就是破坏细胞间的粘连。
15楼2014-05-02 08:00:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yyc12596

新虫 (著名写手)

之前是用100V,1xTG湿转, 4度转2小时。昨天担心胶上的蛋白没完全转过去,用考马斯亮蓝染色了一下转膜之后的胶。
    Marker转得很干净,胶上没残余。
    胶上大概有4条比较明显的带,最亮的那条应该是beta-actin.
   
      目标蛋白本来就不浓,反而看不出来转过去的比例。

    同样的样本,试了4度,40V转过夜(19h),考马斯亮蓝染色。现在还在染,但是貌似胶上基本没有残余条带。所以,目前认为还是40V转过夜会转得比较彻底。
16楼2014-05-03 01:39:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yyc12596

新虫 (著名写手)

终于看到目标蛋白了!

     排除各种条件,细胞裂解液的成分是最关键的。

      Laemmli sample buffer,37度30分钟裂解,再50度20分钟加热,40v湿转过夜,PBST洗涤,条带就出来了!

      接下来就是设计各种对照组,看看哪个试剂或者哪个步骤导致最初的目的条带没出来。
17楼2014-05-03 04:23:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yyc12596

新虫 (著名写手)

一直在用的细胞裂解液(用的时候临时加ROCHE的蛋白酶抑制剂),没有跑出来过目标蛋白条带:
25mM tris
150mM NaCl
1mM EDTA
1% NP-40
5% glycerol

直接用了loading buffer,可以出来条带:
65.8 mM Tris-HCl, pH 6.8, 2.1% SDS, 26.3% (w/v) glycerol, 0.01% bromophenol blue

文献中标准裂解液配方:
1%SDS
5mm IAA
0.5mM PMSF
1xPIC
1%Benzonase
1xTBS

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

18楼2014-05-03 06:49:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yyc12596

新虫 (著名写手)

所以首先就要考虑NP-40,EDTA分别对于目标蛋白的影响。

样本的处理就一直用37x30min,50x20min来处理吧。暂时不想折腾温度。

另外是100V,2h与40V,20h对于目标蛋白的影响。其一是目标蛋白转膜是否干净,另外一点是100V时候虽然中途换过一次冰盒,但是转膜缓冲液烫手,温度应该高于50度,有可能目标蛋白在这种温度高的缓冲液中不知不觉地就消失了。

洗脱液,TBST与PBST的区别。跑出来的这次是用PBST洗脱的,但是我不确定这两者之间是否真有那么大差别?PBST应该比较温和。

封闭液:5%BSA与5%milk之间的区别。不知道会不会有大的影响。做出来条带的时候用了BSA封闭的,但是一抗二抗还是在5%milk里的。

一抗的区别:R&D, Abcam,Enzo。
Enzo一抗终浓度2ug/ml。二抗终浓度0.2ug/ml。
其他两家的抗体之前没做出来,但是不知道是不是抗体的原因。
19楼2014-05-03 07:20:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yyc12596

新虫 (著名写手)

最后成功经验:

一抗用 MRPr1 α-MRP1 (Enzo Life Sciences)
稀释到2ug/ml

其他家的MRP1一抗WB都不好用。

二抗用了Santa的anti-rat。1:2000稀释。

裂解液:1%SDS.

用NP40会没有MRP1条带。用Triton X100裂解效果没有SDS好。


转膜,加热,洗涤按照正常WB步骤来就可以。我做过各种对照试验确认过。

主要问题就是裂解液和一抗。
20楼2014-06-30 23:29:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 yyc12596 的主题更新
普通表情 高级回复(可上传附件)
信息提示
请填处理意见