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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » 170kDa膜蛋白MRP1跑WB遇到问题
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yyc12596

新虫 (著名写手)
蛋白酶抑制剂混合液(100×PIC)  


蛋白酶抑制剂(Protease Inhibitor)指与蛋白酶分子活性中心上的一些基团结合，使蛋白酶活力下降，
甚至消失，但不使酶蛋白变性的物质。蛋白酶抑制剂有很多种，包括EDTA、E-64、NaVO3、Bestatin、Leupetin、Pepstatin A、Aprotinin等，可以有效抑制蛋白的降解，并维持原有的蛋白间相互作用。  

蛋白酶抑制剂混合液(100×PIC)主要由Leupetin、Pepstatin A、 Aprotinin、E-64等组成，不含
EDTA。该混合物可以抑制绝大多数蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱胺酸蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等。该蛋白酶抑制剂混合液是100×的浓缩的DMSO溶液，适用于从哺乳动物组织、细胞中提取蛋白质，能够更有效的获得目的蛋白质。提取出来的蛋白可以用于Western Blot、免疫共沉淀等试验。
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11楼2014-05-02 05:35:57
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yyc12596

新虫 (著名写手)
在网上搜到的类似疑问：

当我们制作细胞裂解液的时候，会丢失大部分的膜蛋白，有的是降解了有的是没办法收集，因此当我们用细胞裂解液做CD系列蛋白WB的时候很难做出来。一般用流式细胞和免疫银光检测比较容易出结果。
        在此我就想请问高手，如何在制作细胞裂解也的时候更好的保护膜蛋白，让它的损失尽可能的少，有人会叫我用膜蛋白提取试剂盒，我们试过效果还是不好。我们甚至试过用buffer直接煮细胞上样、buffer超声细胞离心上样、冰浴裂解，都试过，现在就是要考虑一下、裂解液的盐浓度是否与它有关。
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12楼2014-05-02 05:53:15
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yyc12596

新虫 (著名写手)
一直在用的细胞裂解液配方：

25mM tris
150mM NaCl
1mM EDTA
1% NP-40
5% glycerol
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13楼2014-05-02 07:53:59
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yyc12596

新虫 (著名写手)
关于细胞裂解时几种去垢剂的作用：

SDS ，NP-40 ，TritonX-100这三种去垢剂的作用是不同的，或者说作用力量强弱不同。

SDS属于离子型去垢剂，最厉害，基本可以把细胞完全破掉，DNA会释放出来，裂解液变得很粘稠。

NP-40是很温和的去垢剂，1%浓度的基本可以破坏掉胞膜，而对核膜破坏的作用弱，结合特定的buffer可以获得胞浆蛋白。

TritonX-100的能力介于NP40和SDS之间，偏向于NP40，也是常用的细胞裂解液成分之一，在保护蛋白活性方面有一定作用（SDS基本会使蛋白变性失活）。
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14楼2014-05-02 07:57:05
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yyc12596

新虫 (著名写手)
在蛋白裂解液中EDTA是螯合游离的金属离子的作用，达到降低金属蛋白酶的效果，减少蛋白的降解。

胰酶中的EDTA主要是螯合细胞表面或培养液中的游离的二价的金属离子，减少金属离子对胰酶的抑制作用，但其对细胞贴壁有影响，如果细胞容易消化，可不加EDTA。

EDTA是一种螯合剂，它可以螯合Ca2+或Mg2+,而细胞表面很多和培养皿或培养瓶结合的蛋白都是带有Ca2+或Mg2+的，把这些离子螯合后，可以加速细胞和培养皿的脱离，促进消化.EDTA是2价阳离子螯合剂，所以能螯合钙、镁等离子。上皮类细胞的连接存在“桥粒”结构，是细胞间最“牢固”的连接，但桥粒的形成依赖于钙离子的存在。在胰酶消化细胞时，加入EDTA，可以破坏细胞的桥粒结构，使细胞能够分散成单个细胞。通俗地说，就是破坏细胞间的粘连。
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15楼2014-05-02 08:00:25
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yyc12596

新虫 (著名写手)
之前是用100V,1xTG湿转, 4度转2小时。昨天担心胶上的蛋白没完全转过去，用考马斯亮蓝染色了一下转膜之后的胶。
    Marker转得很干净，胶上没残余。
    胶上大概有4条比较明显的带，最亮的那条应该是beta-actin.
   
      目标蛋白本来就不浓，反而看不出来转过去的比例。

    同样的样本，试了4度，40V转过夜（19h），考马斯亮蓝染色。现在还在染，但是貌似胶上基本没有残余条带。所以，目前认为还是40V转过夜会转得比较彻底。
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16楼2014-05-03 01:39:02
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yyc12596

新虫 (著名写手)
终于看到目标蛋白了！

     排除各种条件，细胞裂解液的成分是最关键的。

      Laemmli sample buffer，37度30分钟裂解，再50度20分钟加热，40v湿转过夜，PBST洗涤，条带就出来了！

      接下来就是设计各种对照组，看看哪个试剂或者哪个步骤导致最初的目的条带没出来。
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17楼2014-05-03 04:23:35
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yyc12596

新虫 (著名写手)
一直在用的细胞裂解液（用的时候临时加ROCHE的蛋白酶抑制剂），没有跑出来过目标蛋白条带：
25mM tris
150mM NaCl
1mM EDTA
1% NP-40
5% glycerol

直接用了loading buffer，可以出来条带：
65.8 mM Tris-HCl, pH 6.8, 2.1% SDS, 26.3% (w/v) glycerol, 0.01% bromophenol blue

文献中标准裂解液配方：
1%SDS
5mm IAA
0.5mM PMSF
1xPIC
1%Benzonase
1xTBS
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carolyn_cat
18楼2014-05-03 06:49:20
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yyc12596

新虫 (著名写手)
所以首先就要考虑NP-40，EDTA分别对于目标蛋白的影响。

样本的处理就一直用37x30min，50x20min来处理吧。暂时不想折腾温度。

另外是100V,2h与40V,20h对于目标蛋白的影响。其一是目标蛋白转膜是否干净，另外一点是100V时候虽然中途换过一次冰盒，但是转膜缓冲液烫手，温度应该高于50度，有可能目标蛋白在这种温度高的缓冲液中不知不觉地就消失了。

洗脱液，TBST与PBST的区别。跑出来的这次是用PBST洗脱的，但是我不确定这两者之间是否真有那么大差别？PBST应该比较温和。

封闭液：5%BSA与5%milk之间的区别。不知道会不会有大的影响。做出来条带的时候用了BSA封闭的，但是一抗二抗还是在5%milk里的。

一抗的区别：R&D, Abcam，Enzo。
Enzo一抗终浓度2ug/ml。二抗终浓度0.2ug/ml。
其他两家的抗体之前没做出来，但是不知道是不是抗体的原因。
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19楼2014-05-03 07:20:50
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yyc12596

新虫 (著名写手)
最后成功经验：

一抗用 MRPr1 α-MRP1 (Enzo Life Sciences)
稀释到2ug/ml

其他家的MRP1一抗WB都不好用。

二抗用了Santa的anti-rat。1:2000稀释。

裂解液：1%SDS.

用NP40会没有MRP1条带。用Triton X100裂解效果没有SDS好。


转膜，加热，洗涤按照正常WB步骤来就可以。我做过各种对照试验确认过。

主要问题就是裂解液和一抗。
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20楼2014-06-30 23:29:00
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