| 查看: 4011 | 回复: 39 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
yyc12596新虫 (著名写手)
|
[交流]
170kDa膜蛋白MRP1跑WB遇到问题已有7人参与
|
||
|
需要做一个膜蛋白，MRP1，分子量170kDa. WB一直遇到问题，没有拿到自己的目的条带。 使用了Thermo的膜蛋白提取试剂盒，细胞裂解和离心都是在冰上或者四度进行的。膜蛋白和胞浆蛋白在-20度冻存。 因为膜蛋白100度煮沸5分钟据说会沉淀，所以样本解冻之后1:1加lamaelli（5%2-ME）loading buffer，37度温育30分钟，然后直接上样。BIO-RAD的4-15%的胶。 之后恒压100V,湿转2小时。中间换一次冰盒。电流从0.3A会增高到0.45A. 封闭，一抗，二抗，显影。 标本用了人THP-1细胞株（未用PMA分化），以及人血来源的巨噬细胞（M-CSF分化）。 一抗用了R&D的MRP1(QCRL,MAB19291),Abcam的MRP1(IU2H10，识别MRP1的1-33aa)。两支抗体孵育出的条带都在55kDa大小！ 下图是Abcam一抗孵育之后。 |
回复此楼» 猜你喜欢
博士读完未来一定会好吗
已经有21人回复
-
导师想让我从独立一作变成了共一第一
已经有5人回复
-
到新单位后，换了新的研究方向，没有团队，持续积累2区以上论文，能申请到面上吗
已经有11人回复
-
读博
已经有4人回复
-
JMPT 期刊投稿流程
已经有4人回复
-
心脉受损
已经有5人回复
-
Springer期刊投稿求助
已经有4人回复
-
小论文投稿
已经有3人回复
-
Bioresource Technology期刊，第一次返修的时候被退回好几次了
已经有9人回复
-
申请2026年博士
已经有6人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
yyc12596
新虫 (著名写手)
- 应助: 10 (幼儿园)
- 金币: 10847.3
- 散金: 2230
- 红花: 34
- 帖子: 2270
- 在线: 355.1小时
- 虫号: 2034994
- 注册: 2012-09-28
- 性别: MM
- 专业: 白血病
|
蛋白酶抑制剂混合液(100×PIC) 蛋白酶抑制剂(Protease Inhibitor)指与蛋白酶分子活性中心上的一些基团结合，使蛋白酶活力下降， 甚至消失，但不使酶蛋白变性的物质。蛋白酶抑制剂有很多种，包括EDTA、E-64、NaVO3、Bestatin、Leupetin、Pepstatin A、Aprotinin等，可以有效抑制蛋白的降解，并维持原有的蛋白间相互作用。 蛋白酶抑制剂混合液(100×PIC)主要由Leupetin、Pepstatin A、 Aprotinin、E-64等组成，不含 EDTA。该混合物可以抑制绝大多数蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱胺酸蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等。该蛋白酶抑制剂混合液是100×的浓缩的DMSO溶液，适用于从哺乳动物组织、细胞中提取蛋白质，能够更有效的获得目的蛋白质。提取出来的蛋白可以用于Western Blot、免疫共沉淀等试验。 |
11楼2014-05-02 05:35:57
yyc12596
新虫 (著名写手)
- 应助: 10 (幼儿园)
- 金币: 10847.3
- 散金: 2230
- 红花: 34
- 帖子: 2270
- 在线: 355.1小时
- 虫号: 2034994
- 注册: 2012-09-28
- 性别: MM
- 专业: 白血病
2楼2014-04-30 03:43:06
yyc12596
新虫 (著名写手)
- 应助: 10 (幼儿园)
- 金币: 10847.3
- 散金: 2230
- 红花: 34
- 帖子: 2270
- 在线: 355.1小时
- 虫号: 2034994
- 注册: 2012-09-28
- 性别: MM
- 专业: 白血病
|
文献上的方法： Latency-Associated Degradation of the MRP1 Drug Transporter During Latent Human Cytomegalovirus Infection Michael P. Weekes, Shireen Y. L. Tan, Emma Poole, Suzanne Talbot, Robin Antrobus, Duncan L. Smith, Christina Montag, Steven P. Gygi, John H. Sinclair, Paul J. Lehner* *Corresponding author. E-mail pjl30@cam.ac.uk Published 12 April 2013, Science 340, 199 (2013) Primary antibodies used for immunoblotting were: MRPr1 α-MRP1 (Enzo Life Sciences) Immunoblotting ： For immunoblots, cells were lysed in SDS sample buffer in TBS with 1% benzonase. Lysates were heated for 30 min at 37°C, separated by SDS/PAGE (UL138 -12% polyacrylamide gel; MRP1 - 7% polyacrylamide gel) and transferred to PVDF membranes (Millipore). For MRP1, membranes were denatured with 6M guanidinium chloride. Reactive bands were detected by SuperSignal West Pico or Dura substrates (Thermo). |
3楼2014-04-30 03:46:21
yyc12596
新虫 (著名写手)
- 应助: 10 (幼儿园)
- 金币: 10847.3
- 散金: 2230
- 红花: 34
- 帖子: 2270
- 在线: 355.1小时
- 虫号: 2034994
- 注册: 2012-09-28
- 性别: MM
- 专业: 白血病
|
现在怀疑目标蛋白是不是被降解了？55KDA的条带让人很不舒坦。 上样： 2x Laemmli Sample Buffer #161-0737 Dilute protein samples 1:1 in 2x Laemmli sample buffer before loading on SDS-PAGE gels (requires the addition of β-mercaptoethanol). •Formulation: 65.8 mM Tris-HCl, pH 6.8, 2.1% SDS, 26.3% (w/v) glycerol, 0.01% bromophenol blue |
4楼2014-04-30 03:51:57