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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)


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5楼: Originally posted by yyc12596 at 2014-04-30 04:00:07
1% benzonase的作用:

Benzonase® endonuclease has been especially designed for applications in biotechnological processing, such as:
• removing DNA/RNA from proteins and other biolog ...

别闹了,跟你的实验完全不搭调
21楼2014-07-01 16:41:42
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yyc12596

新虫 (著名写手)

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21楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-07-01 16:41:42
别闹了,跟你的实验完全不搭调...

这个方案是从提到的S文章里的原作者那里拿到的。所以我才会认真考虑。这有什么闹不闹的!不带你这样评论的。

最后经过对照实验排除了很多影响因素,把条带跑出来了,就可以了。
22楼2014-07-03 03:26:05
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yyc12596

新虫 (著名写手)

还是MRP1蛋白问题。

   流式时候,BD Pharmingen买的FITC MOUSE Anti-Human MRP1(QCRL-3)在THP1细胞里,经过固定和透膜后非阳性。跟Isotype FITC差不多。

    以前在人的外周血上跑过很多胞内蛋白的流式,都很好。

    MRP1这个蛋白实在太奇怪了。除了免疫荧光正常做出来了,WB和流式结果都没有一次性就出来。
23楼2014-07-03 03:39:48
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yyc12596

新虫 (著名写手)

FACS问题解决方案:
1.怀疑透膜和固定不够。之前用了eBioscience的固定剂4度过夜,然后用它的透膜剂。现在准备试试4%PFA固定,0.3%TritonX100透膜,然后染直标抗体看看。间标抗体上次阳性,现在拿来做阳性对照。

2.怀疑BD的抗体有问题。不过BD的流式抗体一直很好用,现在买的直标抗体确实是抗人的,FITC通道,过期时间是明年。各方面看起来都正常。所以,对抗体的怀疑会放到最后,先验证其他问题。

3.细胞株有问题。WB和荧光染色都没问题,所以基本不存在细胞株本身没有这个蛋白的问题。

做实验老遇到这种无聊的原因,想着根本不可能做不出来的时候,偏偏会出点问题做不出来。
24楼2014-07-03 03:47:11
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gaohy555

禁虫 (小有名气)


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25楼2014-12-18 09:52:51
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yyc12596

新虫 (著名写手)

我做MRP1遇到的问题和解决方案都写在了这个帖子里。请遇到类似的问题的虫子们自己看帖子即可。
26楼2015-02-24 02:50:49
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yyc12596

新虫 (著名写手)

引用回帖:
24楼: Originally posted by yyc12596 at 2014-07-02 11:47:11
FACS问题解决方案:
1.怀疑透膜和固定不够。之前用了eBioscience的固定剂4度过夜,然后用它的透膜剂。现在准备试试4%PFA固定,0.3%TritonX100透膜,然后染直标抗体看看。间标抗体上次阳性,现在拿来做阳性对照。
...

流式是BD公司的直标抗体有问题。后来他们给免费换了间接标记的抗体,流式结果就做出来了。

   直标抗体可能是他们运输过程中出了问题。
27楼2015-02-24 02:52:26
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carolyn_cat

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18楼: Originally posted by yyc12596 at 2014-05-03 06:49:20
一直在用的细胞裂解液(用的时候临时加ROCHE的蛋白酶抑制剂),没有跑出来过目标蛋白条带:
25mM tris
150mM NaCl
1mM EDTA
1% NP-40
5% glycerol

直接用了loading buffer,可以出来条带:
65.8 mM Tris-H ...

楼主,您好,看到您的帖子发现您做的蛋白和我的和相似,我现在做WB卡在了您之前样品降解的情况那,我想请问您成功的经验。想请教一下您是用什么裂解液的?您上面写的“ Laemmli sample buffer,37度30分钟裂解,再50度20分钟加热,40v湿转过夜,PBST洗涤,条带就出来了!”, Laemmli sample buffer是loading buffer吗?
28楼2016-06-16 20:32:59
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yyc12596

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引用回帖:
28楼: Originally posted by carolyn_cat at 2016-06-16 20:32:59
楼主,您好,看到您的帖子发现您做的蛋白和我的和相似,我现在做WB卡在了您之前样品降解的情况那,我想请问您成功的经验。想请教一下您是用什么裂解液的?您上面写的“ Laemmli sample buffer,37度30分钟裂解,再 ...

是的。就是BIO-RAD公司买的那种loading  buffer, 直接拿来裂解细胞了。

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29楼2016-06-17 09:32:27
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carolyn_cat

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引用回帖:
29楼: Originally posted by yyc12596 at 2016-06-17 09:32:27
是的。就是BIO-RAD公司买的那种loading  buffer, 直接拿来裂解细胞了。
...

您好,请问您是加多少裂解液进去裂解细胞?您上面说的“37度30分钟裂解,再50度20分钟加热”,是指刮了细胞收集到ep管后37度再裂解30分钟吗?这样子蛋白不会降解吗?非常感谢您!
30楼2016-06-17 09:51:47
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