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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » 170kDa膜蛋白MRP1跑WB遇到问题
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)
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5楼: Originally posted by yyc12596 at 2014-04-30 04:00:07
1% benzonase的作用：

Benzonase® endonuclease has been especially designed for applications in biotechnological processing, such as:
• removing DNA/RNA from proteins and other biolog ...

别闹了，跟你的实验完全不搭调
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21楼2014-07-01 16:41:42
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yyc12596

新虫 (著名写手)
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21楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-07-01 16:41:42
别闹了，跟你的实验完全不搭调...

这个方案是从提到的S文章里的原作者那里拿到的。所以我才会认真考虑。这有什么闹不闹的！不带你这样评论的。

最后经过对照实验排除了很多影响因素，把条带跑出来了，就可以了。
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22楼2014-07-03 03:26:05
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yyc12596

新虫 (著名写手)
还是MRP1蛋白问题。

   流式时候，BD Pharmingen买的FITC MOUSE Anti-Human MRP1(QCRL-3)在THP1细胞里，经过固定和透膜后非阳性。跟Isotype FITC差不多。

    以前在人的外周血上跑过很多胞内蛋白的流式，都很好。

    MRP1这个蛋白实在太奇怪了。除了免疫荧光正常做出来了，WB和流式结果都没有一次性就出来。
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23楼2014-07-03 03:39:48
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yyc12596

新虫 (著名写手)
FACS问题解决方案：
1.怀疑透膜和固定不够。之前用了eBioscience的固定剂4度过夜，然后用它的透膜剂。现在准备试试4%PFA固定，0.3%TritonX100透膜，然后染直标抗体看看。间标抗体上次阳性，现在拿来做阳性对照。

2.怀疑BD的抗体有问题。不过BD的流式抗体一直很好用，现在买的直标抗体确实是抗人的，FITC通道，过期时间是明年。各方面看起来都正常。所以，对抗体的怀疑会放到最后，先验证其他问题。

3.细胞株有问题。WB和荧光染色都没问题，所以基本不存在细胞株本身没有这个蛋白的问题。

做实验老遇到这种无聊的原因，想着根本不可能做不出来的时候，偏偏会出点问题做不出来。
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24楼2014-07-03 03:47:11
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gaohy555

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25楼2014-12-18 09:52:51
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yyc12596

新虫 (著名写手)
我做MRP1遇到的问题和解决方案都写在了这个帖子里。请遇到类似的问题的虫子们自己看帖子即可。
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26楼2015-02-24 02:50:49
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yyc12596

新虫 (著名写手)
引用回帖:
24楼: Originally posted by yyc12596 at 2014-07-02 11:47:11
FACS问题解决方案：
1.怀疑透膜和固定不够。之前用了eBioscience的固定剂4度过夜，然后用它的透膜剂。现在准备试试4%PFA固定，0.3%TritonX100透膜，然后染直标抗体看看。间标抗体上次阳性，现在拿来做阳性对照。
...

流式是BD公司的直标抗体有问题。后来他们给免费换了间接标记的抗体，流式结果就做出来了。

   直标抗体可能是他们运输过程中出了问题。
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27楼2015-02-24 02:52:26
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carolyn_cat

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18楼: Originally posted by yyc12596 at 2014-05-03 06:49:20
一直在用的细胞裂解液（用的时候临时加ROCHE的蛋白酶抑制剂），没有跑出来过目标蛋白条带：
25mM tris
150mM NaCl
1mM EDTA
1% NP-40
5% glycerol

直接用了loading buffer，可以出来条带：
65.8 mM Tris-H ...

楼主，您好，看到您的帖子发现您做的蛋白和我的和相似，我现在做WB卡在了您之前样品降解的情况那，我想请问您成功的经验。想请教一下您是用什么裂解液的？您上面写的“ Laemmli sample buffer，37度30分钟裂解，再50度20分钟加热，40v湿转过夜，PBST洗涤，条带就出来了！”， Laemmli sample buffer是loading buffer吗？
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28楼2016-06-16 20:32:59
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yyc12596

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引用回帖:
28楼: Originally posted by carolyn_cat at 2016-06-16 20:32:59
楼主，您好，看到您的帖子发现您做的蛋白和我的和相似，我现在做WB卡在了您之前样品降解的情况那，我想请问您成功的经验。想请教一下您是用什么裂解液的？您上面写的“ Laemmli sample buffer，37度30分钟裂解，再 ...

是的。就是BIO-RAD公司买的那种loading  buffer, 直接拿来裂解细胞了。

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carolyn_cat
29楼2016-06-17 09:32:27
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carolyn_cat

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29楼: Originally posted by yyc12596 at 2016-06-17 09:32:27
是的。就是BIO-RAD公司买的那种loading  buffer, 直接拿来裂解细胞了。
...

您好，请问您是加多少裂解液进去裂解细胞？您上面说的“37度30分钟裂解，再50度20分钟加热”，是指刮了细胞收集到ep管后37度再裂解30分钟吗？这样子蛋白不会降解吗？非常感谢您！
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30楼2016-06-17 09:51:47
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