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biostar2009

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[交流] TouchDown PCR的基本原理和主要优势已有7人参与

总能看见有人关注touchdown PCR，但是感觉很多人并不清楚原理。

touchdown PCR的主要特色就是逐步降低PCR中的annealing温度，主要目的是提高PCR的特异性，或者降低非特异性的产物。

但是逐步降低PCR annealing温度，如何就能起到降低非特异性产物的作用呢？

所谓的非特异性产物，本质上是引物的错配，引物与模板中的其他位置能够产生足够引起延伸的错配。

比如20nt的引物，与设计的扩展位置肯定是20个好好的完全配对，Tm值有60oC，

而在模板的某一个其他位置，还是这个引物，能够与某段序列有19nt的配对，Tm值有59.5oC，假设。

这里还要明白，Tm是什么意思？是两条DNA之间有50%发生配对的温度，也就是说，一个Tm=60oC的引物，在60oC时，有一半的free primer可以发生配对。那在58oC时可能是60%，而在65oC时可能是30%。

回到这样一种情况，如果PCR的annealing温度设置在58oC，这条引物在这两个位置的annealing程度相差不大，所以这两个地方均可以实现相当程度的延伸。

但是如果还是这种情况，在touchdown PCR的程序中，从一个很高温度向引物Tm donwn的过程中，会发生什么情况呢？

会有那么一个温度，在这个温度上，完美配对的引物结合位置，能够引发一次有效的延伸，而完美配对的引物结合位置，因为引物的配对效率低，没能引发一次有效的延伸。或者更严谨的说法是，会有那么一段温度区间。完美配对的引物结合位点相对于不完美配对的位点，会以更高的效率延伸。要注意，这点区别在一开始可能是非常细微的区别。

一个简单的计算，某个引物存在A和B两个结合位置，A处是完美配对，B处略微的错配，Tm可能只差0.2oC

即便如此，比如在70oC时，A处延伸了3个分子，而因为B处引物配对效率较低，只延伸了1个分子。

那么到了下一个cycles时，完美配对的结合位置将是3+1=4个，而不完美配对只有1+1=2个。

这就实现了差距化，在随后的cycles中，这种差距将进行指数性的扩大。

这就是touchdown能够消除杂带的原因。哪怕错配位点与完美配对位点只有细微的Tm区别。

所以设置touchdown程序的时候，要注意把温度梯度拉大一些。

我的经验，一般而言，从74oC开始，到60oC，可以显著的提高特异性。

对于一些更差的引物，从更高的80oC开始，可以比74oC有明显提高。

这个需要预实验摸索，也不是说从95oC开始最好了，这样导致程序变得很长时间。满足需要就可以了。

所以同理可以看出，为什么说touchdown只是锦上添花，如果主带都看不出来，touchdown能够发挥的空间就不大了。

最后还有一个观点，PCR产物的特异性是由上下游两个引物共同决定的

比如引物A和B，对mRNA α是完美引物，是上下游关系。

而发现引物A在mRNA β上还有一个一模一样的结合位点。

引物B在mRNAγ上也有一个一模一样的结合位点。

对于α mRNA而言，A和B是指数扩增，而β和γ mRNA均是线性扩增，随着PCR的进行，模板浓度会急剧下降。

所以设计引物的时候错配并不要紧，要紧是在同一条mRNA，或者DNA上是否有错配。

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