| 查看: 7760 | 回复: 7 | |||||||
biostar2009专家顾问 (正式写手)
|
[交流]
TouchDown PCR的基本原理和主要优势 已有7人参与
|
|
总能看见有人关注touchdown PCR，但是感觉很多人并不清楚原理。 touchdown PCR的主要特色就是逐步降低PCR中的annealing温度，主要目的是提高PCR的特异性，或者降低非特异性的产物。 但是逐步降低PCR annealing温度，如何就能起到降低非特异性产物的作用呢？ 所谓的非特异性产物，本质上是引物的错配，引物与模板中的其他位置能够产生足够引起延伸的错配。 比如20nt的引物，与设计的扩展位置肯定是20个好好的完全配对，Tm值有60oC， 而在模板的某一个其他位置，还是这个引物，能够与某段序列有19nt的配对，Tm值有59.5oC，假设。 这里还要明白，Tm是什么意思？是两条DNA之间有50%发生配对的温度，也就是说，一个Tm=60oC的引物，在60oC时，有一半的free primer可以发生配对。那在58oC时可能是60%，而在65oC时可能是30%。 回到这样一种情况，如果PCR的annealing温度设置在58oC，这条引物在这两个位置的annealing程度相差不大，所以这两个地方均可以实现相当程度的延伸。 但是如果还是这种情况，在touchdown PCR的程序中，从一个很高温度向引物Tm donwn的过程中，会发生什么情况呢？ 会有那么一个温度，在这个温度上，完美配对的引物结合位置，能够引发一次有效的延伸，而完美配对的引物结合位置，因为引物的配对效率低，没能引发一次有效的延伸。或者更严谨的说法是，会有那么一段温度区间。完美配对的引物结合位点相对于不完美配对的位点，会以更高的效率延伸。要注意，这点区别在一开始可能是非常细微的区别。 一个简单的计算，某个引物存在A和B两个结合位置，A处是完美配对，B处略微的错配，Tm可能只差0.2oC 即便如此，比如在70oC时，A处延伸了3个分子，而因为B处引物配对效率较低，只延伸了1个分子。 那么到了下一个cycles时，完美配对的结合位置将是3+1=4个，而不完美配对只有1+1=2个。 这就实现了差距化，在随后的cycles中，这种差距将进行指数性的扩大。 这就是touchdown能够消除杂带的原因。哪怕错配位点与完美配对位点只有细微的Tm区别。 所以设置touchdown程序的时候，要注意把温度梯度拉大一些。 我的经验，一般而言，从74oC开始，到60oC，可以显著的提高特异性。 对于一些更差的引物，从更高的80oC开始，可以比74oC有明显提高。 这个需要预实验摸索，也不是说从95oC开始最好了，这样导致程序变得很长时间。满足需要就可以了。 所以同理可以看出，为什么说touchdown只是锦上添花，如果主带都看不出来，touchdown能够发挥的空间就不大了。 最后还有一个观点，PCR产物的特异性是由上下游两个引物共同决定的 比如引物A和B，对mRNA α是完美引物，是上下游关系。 而发现引物A在mRNA β上还有一个一模一样的结合位点。 引物B在mRNAγ上也有一个一模一样的结合位点。 对于α mRNA而言，A和B是指数扩增，而β和γ mRNA均是线性扩增，随着PCR的进行，模板浓度会急剧下降。 所以设计引物的时候错配并不要紧，要紧是在同一条mRNA，或者DNA上是否有错配。 |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 分子实验 | 虫友问答-分子生物 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
» 猜你喜欢
生物质炭与活化剂氢氧化钾混合注意事项
已经有0人回复
-
科研人必读：新一代 KRAS G12C 抑制剂 Olomorasib 的研究进展
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有298人回复
-
BT-11（Omilancor）研究化合物全解析：从分子结构到实验应用要点
已经有0人回复
-
富马酸贝达喹啉：二芳基喹啉类工具化合物的化学特征
已经有0人回复
-
BT投稿with editor状态快两周了，正常吗
已经有25人回复
-
Silevertinib（BDTX-1535）结构拆解：炔基双环片段为何成为合成瓶颈
已经有0人回复
-
RO4929097 解析：双苯并氮杂䓬骨架与 Notch 通路实验设计要点
已经有0人回复
-
分子量 1157 的 PROTAC 怎么配不析出：SGK3-PROTAC1 的溶解、分装与图谱复核
已经有0人回复
-
logP 6.1 的羧酸怎么配母液：GSK 650394 的溶解窗口与稀释顺序
已经有0人回复
-
从"水不溶"到 71 mg/mL：雷特格韦的 pH 依赖溶解与螯合色谱边界
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 就鉴别双歧杆菌
已经有29人回复
- 和touchdownPCR有关的
已经有5人回复
- 【求助/交流】引物设计信息如此，touchdownPCR如何设计？
已经有7人回复
- 【求助/交流】关于降落pcr的问题！
已经有4人回复
- 【专题】PCR实验技术指南
已经有535人回复
 |
2楼2014-03-28 23:08:15
 |
3楼2014-04-02 19:24:24
|
谢谢分享 [ 发自手机版 http://muchong.com/3g ] |
4楼2014-04-11 15:55:24
送红花一朵
 |
5楼2014-10-12 23:20:21
6楼2014-12-10 20:21:10
不羁的醒与醉
新虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 1144
- 散金: 10
- 帖子: 208
- 在线: 7.9小时
- 虫号: 7389181
- 注册: 2017-10-29
- 性别: MM
- 专业: 遗传学与生物信息学
7楼2018-11-19 20:14:58
LN蓝天绿树
新虫 (著名写手)
- 应助: 2 (幼儿园)
- 金币: 6278.1
- 散金: 10
- 红花: 1
- 帖子: 1179
- 在线: 37.5小时
- 虫号: 5391259
- 注册: 2016-12-23
- 性别: GG
- 专业: 药物学
8楼2022-12-30 17:03:29
