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星星杨

铜虫 (初入文坛)

[交流] 就鉴别双歧杆菌

哪位大侠做过用16S鉴别双歧杆菌啊？用细菌通用引物能做吗？谢谢！
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1楼 2013-03-20 10:41:51
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taoqi1986918

铜虫 (小有名气)
★
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引用回帖:
23楼: Originally posted by 星星杨 at 2013-03-26 13:13:09
我问过学校所有实验室了，一般的PCR仪没法做TD-PCR，还有别的办法没？不知道这位仁兄用的是什么引物啊？...

不可能啊 很老的仪器都是能做的TD-PCR的 你问问伯乐的工程师 我的引物就是通用的额
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27楼2013-03-26 13:30:04
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freerain

禁虫 (职业作家)
★
星星杨(金币+1): 谢谢参与
本帖内容被屏蔽
2楼2013-03-20 10:54:41
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星星杨

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by freerain at 2013-03-20 10:54:41
16S 通用引物就可以哈

我这几天在做16S双歧杆菌的鉴定，刚开始跑没条带，后来好不容易有了，可又好多条带，郁闷啊！可否帮我分析一下啊？谢谢啊！条件是：
94度    4分钟
94度   30秒
55度   30秒
72度   2分钟
30个循环
72度  10分钟
梯度PCR也做了，条带也很多，这么办啊？
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    • 2013-03-20 16:37:31, 646 K
3楼2013-03-20 16:42:04
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tianhome

木虫 (知名作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
朋友，我没做过鉴定，但理论上讲，用通用引物是没问题的。先试试用刚刚提取出来的基因组作模板，如果还不行，就换个taq酶吧。
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星星杨
7楼2013-03-21 05:42:49
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che314

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
应该做个菌落Pcr就可以了吧
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9楼2013-03-21 07:55:08
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星星杨

铜虫 (初入文坛)
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引用回帖:
7楼: Originally posted by tianhome at 2013-03-21 05:42:49
朋友，我没做过鉴定，但理论上讲，用通用引物是没问题的。先试试用刚刚提取出来的基因组作模板，如果还不行，就换个taq酶吧。

刚提取出来的基因做了，没问题，换了个高保真酶，做了，也是这样有好多条带，哎，我都郁闷死了！
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10楼2013-03-21 10:14:00
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freerain

禁虫 (职业作家)
★
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星星杨
12楼2013-03-21 17:13:26
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taoqi1986918

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我以前也遇到过这样的问题，通用引物是可以做的，你可以试一试MIX，用降落PCR可以成功的！祝你好运。
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星星杨
13楼2013-03-21 19:18:25
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星星杨

铜虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
12楼: Originally posted by freerain at 2013-03-21 17:13:26
附件下载不了，我没有装快传

你以适当提高退火温度。
也可以把基因组模板稀释，
减少非特异性扩增

我们鉴定过上百菌株，通用引物没有问题的...

做了个梯度PCR，做出来的也很多条带，除非换引物，可双歧杆菌的引物设计起来好像很麻烦，哎！现在真不知道该怎么办了！
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14楼2013-03-22 08:35:37
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星星杨

铜虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
13楼: Originally posted by taoqi1986918 at 2013-03-21 19:18:25
我以前也遇到过这样的问题，通用引物是可以做的，你可以试一试MIX，用降落PCR可以成功的！祝你好运。

本人不是专门研究分子的，还麻烦大侠说一下MIX，降落PCR是什么东东？
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15楼2013-03-22 08:37:30
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happylj1985

金虫 (正式写手)
谢谢！
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17楼2013-03-22 08:56:50
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taoqi1986918

铜虫 (小有名气)
★
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15楼: Originally posted by 星星杨 at 2013-03-22 08:37:30
本人不是专门研究分子的，还麻烦大侠说一下MIX，降落PCR是什么东东？...

降落PCR（touchdown PCR），一种PCR技术，主要用于PCR的条件的优化。在许多情况下引物的设计使得PCR难以进行，例如特异性不够易错配等。退火温度过高会使PCR效率过低，但退火温度过低则会使非特异扩增过多。这虽然可以通过反复尝试来优化，但费时费力。降落PCR提供了一个较为简易的优化方法。其原理大致是这样的。首先在较高的温度下扩增，此时虽然扩增效率低，但非特异扩增基本没有。随着退火温度的降低，非特异扩增会逐步增多。但由于此时特异的扩增产物已经达到一定的数量优势，因此会对非特异扩增产生强烈的竞争抑制，从而大幅提高PCR的特异性和效率。这一PCR技术已经大量地进入医疗临床应用。现在，以高通量PCR为基础的检测方法、如人的 HLA分型 大多采用这一技术。
设计多循环反应的程序，以使相连循环的退火温度越来越低。由于开始时的退火温度选择为高于估计的Tm值，随着循环的进行，退火温度逐渐降到Tm值，并最终低于这个水平，用于确保第一个引物—模板杂交事件发生在最互补的反应物之间，即那些产生目的扩增产物的反应物之间。尽管退火温度最终会降到非特异杂交的Tm值，但此时目的扩增产物已开始几何扩增，在剩下的循环中处于超过任何滞后（非特异）PCR产物的地位。
说白了就是先提高退火温度，将目的片段扩增出来，然后逐渐降低退火温度，这样做的好处就是能够减少非特异性条带的扩增。
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星星杨
18楼2013-03-22 15:47:16
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星星杨

铜虫 (初入文坛)
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引用回帖:
18楼: Originally posted by taoqi1986918 at 2013-03-22 15:47:16
降落PCR（touchdown PCR），一种PCR技术，主要用于PCR的条件的优化。在许多情况下引物的设计使得PCR难以进行，例如特异性不够易错配等。退火温度过高会使PCR效率过低，但退火温度过低则会使非特异扩增过多。这虽然 ...

谢谢了！很具体，我想问一下，这个TD-PCR在一般的PCR仪上能做吗？还是专门的PCR仪啊？
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19楼2013-03-22 20:25:43
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々暧-〃

版主 (文学泰斗)
祝福祝福~~~~~~
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21楼2013-03-22 23:40:55
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taoqi1986918

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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19楼: Originally posted by 星星杨 at 2013-03-22 20:25:43
谢谢了！很具体，我想问一下，这个TD-PCR在一般的PCR仪上能做吗？还是专门的PCR仪啊？...

一般的就能做 伯乐的老款就是能做 这个你可以看看产品说明书就明白了
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星星杨
22楼2013-03-23 17:09:53
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星星杨

铜虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
22楼: Originally posted by taoqi1986918 at 2013-03-23 17:09:53
一般的就能做 伯乐的老款就是能做 这个你可以看看产品说明书就明白了...

我问过学校所有实验室了，一般的PCR仪没法做TD-PCR，还有别的办法没？不知道这位仁兄用的是什么引物啊？
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23楼2013-03-26 13:13:09
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星星杨

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
27楼: Originally posted by taoqi1986918 at 2013-03-26 13:30:04
不可能啊 很老的仪器都是能做的TD-PCR的 你问问伯乐的工程师 我的引物就是通用的额...

那问一下仁兄的反应体系和反应条件啊
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28楼2013-03-26 15:46:45
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吕晓彤

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
可以 我老师让我用的27 和1492
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29楼2014-12-21 20:57:25
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吕晓彤

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
27楼: Originally posted by taoqi1986918 at 2013-03-26 13:30:04
不可能啊 很老的仪器都是能做的TD-PCR的 你问问伯乐的工程师 我的引物就是通用的额...

想问一下  我是本科生 明天要送双歧杆菌的PCR扩增的去测序了但是查不到测序长度是多少？我用的引物是27和1492
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30楼2014-12-21 20:58:47
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yaoyao1454楼
2013-03-20 16:50   回复  
星星杨(金币+1): 谢谢参与
liwensidun5楼
2013-03-20 17:12   回复  
wingtaizho6楼
2013-03-20 17:22   回复  
wgatssd8楼
2013-03-21 07:34   回复  
孙兵11楼
2013-03-21 10:43   回复  
星星杨16楼
2013-03-22 08:37   回复  
引用回帖:
11楼: Originally posted by 孙兵 at 2013-03-21 10:43:43

licong952720楼
2013-03-22 20:43   回复  
cgcgx24楼
2013-03-26 13:23   回复  
血色狼漫25楼
2013-03-26 13:24   回复  
祝福 [ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
haya051326楼
2013-03-26 13:27   回复  
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