[交流] 就鉴别双歧杆菌

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1楼2013-03-20 10:41:51

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taoqi1986918

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23楼: Originally posted by 星星杨 at 2013-03-26 13:13:09
我问过学校所有实验室了，一般的PCR仪没法做TD-PCR，还有别的办法没？不知道这位仁兄用的是什么引物啊？

...

不可能啊很老的仪器都是能做的TD-PCR的你问问伯乐的工程师我的引物就是通用的额

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27楼2013-03-26 13:30:04

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freerain

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2楼2013-03-20 10:54:41

星星杨

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2楼: Originally posted by freerain at 2013-03-20 10:54:41
16S 通用引物就可以哈

我这几天在做16S双歧杆菌的鉴定，刚开始跑没条带，后来好不容易有了，可又好多条带，郁闷啊！可否帮我分析一下啊？谢谢啊！条件是：
94度 4分钟
94度 30秒
55度 30秒
72度 2分钟
30个循环
72度 10分钟
梯度PCR也做了，条带也很多，这么办啊？

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2013-03-20 16:37:31, 646 K

3楼2013-03-20 16:42:04

tianhome

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朋友，我没做过鉴定，但理论上讲，用通用引物是没问题的。先试试用刚刚提取出来的基因组作模板，如果还不行，就换个taq酶吧。

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7楼2013-03-21 05:42:49

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应该做个菌落Pcr就可以了吧

9楼2013-03-21 07:55:08

星星杨

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7楼: Originally posted by tianhome at 2013-03-21 05:42:49
朋友，我没做过鉴定，但理论上讲，用通用引物是没问题的。先试试用刚刚提取出来的基因组作模板，如果还不行，就换个taq酶吧。

刚提取出来的基因做了，没问题，换了个高保真酶，做了，也是这样有好多条带，哎，我都郁闷死了！

10楼2013-03-21 10:14:00

freerain

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12楼2013-03-21 17:13:26

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我以前也遇到过这样的问题，通用引物是可以做的，你可以试一试MIX，用降落PCR可以成功的！祝你好运。

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13楼2013-03-21 19:18:25

星星杨

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12楼: Originally posted by freerain at 2013-03-21 17:13:26
附件下载不了，我没有装快传

你以适当提高退火温度。
也可以把基因组模板稀释，
减少非特异性扩增

我们鉴定过上百菌株，通用引物没有问题的...

做了个梯度PCR，做出来的也很多条带，除非换引物，可双歧杆菌的引物设计起来好像很麻烦，哎！现在真不知道该怎么办了！

14楼2013-03-22 08:35:37

星星杨

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13楼: Originally posted by taoqi1986918 at 2013-03-21 19:18:25
我以前也遇到过这样的问题，通用引物是可以做的，你可以试一试MIX，用降落PCR可以成功的！祝你好运。

本人不是专门研究分子的，还麻烦大侠说一下MIX，降落PCR是什么东东？

15楼2013-03-22 08:37:30

happylj1985

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17楼2013-03-22 08:56:50

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15楼: Originally posted by 星星杨 at 2013-03-22 08:37:30
本人不是专门研究分子的，还麻烦大侠说一下MIX，降落PCR是什么东东？

...

降落PCR（touchdown PCR），一种PCR技术，主要用于PCR的条件的优化。在许多情况下引物的设计使得PCR难以进行，例如特异性不够易错配等。退火温度过高会使PCR效率过低，但退火温度过低则会使非特异扩增过多。这虽然可以通过反复尝试来优化，但费时费力。降落PCR提供了一个较为简易的优化方法。其原理大致是这样的。首先在较高的温度下扩增，此时虽然扩增效率低，但非特异扩增基本没有。随着退火温度的降低，非特异扩增会逐步增多。但由于此时特异的扩增产物已经达到一定的数量优势，因此会对非特异扩增产生强烈的竞争抑制，从而大幅提高PCR的特异性和效率。这一PCR技术已经大量地进入医疗临床应用。现在，以高通量PCR为基础的检测方法、如人的 HLA分型大多采用这一技术。
设计多循环反应的程序，以使相连循环的退火温度越来越低。由于开始时的退火温度选择为高于估计的Tm值，随着循环的进行，退火温度逐渐降到Tm值，并最终低于这个水平，用于确保第一个引物—模板杂交事件发生在最互补的反应物之间，即那些产生目的扩增产物的反应物之间。尽管退火温度最终会降到非特异杂交的Tm值，但此时目的扩增产物已开始几何扩增，在剩下的循环中处于超过任何滞后（非特异）PCR产物的地位。
说白了就是先提高退火温度，将目的片段扩增出来，然后逐渐降低退火温度，这样做的好处就是能够减少非特异性条带的扩增。

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18楼2013-03-22 15:47:16

星星杨

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18楼: Originally posted by taoqi1986918 at 2013-03-22 15:47:16
降落PCR（touchdown PCR），一种PCR技术，主要用于PCR的条件的优化。在许多情况下引物的设计使得PCR难以进行，例如特异性不够易错配等。退火温度过高会使PCR效率过低，但退火温度过低则会使非特异扩增过多。这虽然 ...

谢谢了！很具体，我想问一下，这个TD-PCR在一般的PCR仪上能做吗？还是专门的PCR仪啊？

19楼2013-03-22 20:25:43