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星星杨

铜虫 (初入文坛)

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[交流] 就鉴别双歧杆菌

哪位大侠做过用16S鉴别双歧杆菌啊？用细菌通用引物能做吗？谢谢！

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1楼 2013-03-20 10:41:51

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taoqi1986918

铜虫 (小有名气)

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引用回帖:

15楼: Originally posted by 星星杨 at 2013-03-22 08:37:30
本人不是专门研究分子的，还麻烦大侠说一下MIX，降落PCR是什么东东？

...

降落PCR（touchdown PCR），一种PCR技术，主要用于PCR的条件的优化。在许多情况下引物的设计使得PCR难以进行，例如特异性不够易错配等。退火温度过高会使PCR效率过低，但退火温度过低则会使非特异扩增过多。这虽然可以通过反复尝试来优化，但费时费力。降落PCR提供了一个较为简易的优化方法。其原理大致是这样的。首先在较高的温度下扩增，此时虽然扩增效率低，但非特异扩增基本没有。随着退火温度的降低，非特异扩增会逐步增多。但由于此时特异的扩增产物已经达到一定的数量优势，因此会对非特异扩增产生强烈的竞争抑制，从而大幅提高PCR的特异性和效率。这一PCR技术已经大量地进入医疗临床应用。现在，以高通量PCR为基础的检测方法、如人的 HLA分型大多采用这一技术。
设计多循环反应的程序，以使相连循环的退火温度越来越低。由于开始时的退火温度选择为高于估计的Tm值，随着循环的进行，退火温度逐渐降到Tm值，并最终低于这个水平，用于确保第一个引物—模板杂交事件发生在最互补的反应物之间，即那些产生目的扩增产物的反应物之间。尽管退火温度最终会降到非特异杂交的Tm值，但此时目的扩增产物已开始几何扩增，在剩下的循环中处于超过任何滞后（非特异）PCR产物的地位。
说白了就是先提高退火温度，将目的片段扩增出来，然后逐渐降低退火温度，这样做的好处就是能够减少非特异性条带的扩增。