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平滑肌细胞transwell实验 已有1人参与
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亲爱的虫友们，我现在在做平滑肌细胞transwell实验，具体步骤如下： 1 制作人工基底膜混合液：取出-20?C冻存的Matrigel凝胶，预置4?C融化后，按1：5比将100ulMatrigel与500ul 无血清DMEM培养基混合，整个操作过程在冰上及无菌条件下进行。 2 包被基底膜：Transwell上室多孔Polycarbonate（聚酯碳酸酯）滤膜上加入人工基底膜混合液50ul，37℃平铺胶化2~3h。 3 准备细胞悬液和小室 （1） 消化法从细胞培养瓶中获取细胞：消化、离心和计数后用无血清DMEM培养基制备成单细胞悬液； （2） 上室加入200ul单细胞悬液（细胞数约为1.5×105/室）； （3） 下室加入800ul含20%FBS的DMEM； （4） 装有Transwell小室的24孔板放置37℃、5%CO2的培养箱中培养。 5 染色和计数 培养结束，取出Transwell小室，PBS洗涤3遍（每遍5min）； 4%多聚甲醛室温固定15min，PBS洗涤3遍 ； 用棉签轻轻擦去上层未穿透膜的VSMC； 0.5%结晶紫染色15~30min，PBS洗涤3遍； 风干，揭下滤膜后反贴在载玻片上，用显微镜低倍镜观察，每个滤膜随机选取3个视野，高倍镜（×200）下分别计数3个视野的穿膜细胞数，计算每个视野的平均细胞数。 我觉得以上步骤是没有问题的，但是我取12h和36h的tanswell小室进行染色，一个细胞都看不到，所以在此想请教各位虫友，是不是时间短，细胞没有侵袭下来？还是我没有染上颜色呢？我买的结晶紫是2.5%的结晶紫染液，用ddH2O稀释成0.5%染的，难道是稀释结晶紫的时候不能用ddH2O，得用无水乙醇或是PBS？你们稀释结晶紫是用什么稀释的啊？ 有没有做过平滑肌细胞迁移的战友啊，你们做的时候平滑肌细胞大约多长时间能侵袭下来啊？ 急求围观。。。。。 |
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