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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 免疫实验 » 新手，第一次IF试验结果，求大神分析
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keaikexin

新虫 (初入文坛)

[求助] 新手，第一次IF试验结果，求大神分析 已有3人参与

3.15b图为绿色荧光，小鼠ES细胞，膜蛋白，一抗比例为1:500，二抗比例为1:100，为什么背景这么绿，细胞荧光反而不够亮？3.15c为DAPI染色，细胞核为什么是一坨的，不应该是一个一个的吗？求大神指教~~~~解救解救后来人~~~~~

新手，第一次IF试验结果，求大神分析
3.15b.jpg


新手，第一次IF试验结果，求大神分析-1
3.15c.jpg
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1楼 2014-03-15 14:04:01
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sageyaya

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
keaikexin: 金币+4, ★★★很有帮助 2014-03-15 16:44:47
建议你下次拍的时候可以拍一个明场，这样可以对照出DAPI的那一片是单个细胞还是细胞碎片，至于绿色，我认为应该是你调的曝光时间过长，可以短一点，背景暗一点，这样细胞就会亮一些，不过我觉得既然是膜蛋白，感觉是没有染上。
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2楼2014-03-15 14:50:50
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keaikexin

新虫 (初入文坛)
★
137167741: 金币+1, 鼓励交流~~ 2014-03-18 08:46:45
引用回帖:
2楼: Originally posted by sageyaya at 2014-03-15 14:50:50
建议你下次拍的时候可以拍一个明场，这样可以对照出DAPI的那一片是单个细胞还是细胞碎片，至于绿色，我认为应该是你调的曝光时间过长，可以短一点，背景暗一点，这样细胞就会亮一些，不过我觉得既然是膜蛋白，感觉是 ...

可是，荧光曝光时间短的话，就很模糊，画面不亮，基本就看不见荧光了……我这个可能放大倍数小，不是单克隆，所以，DAPI也是一团一团的
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3楼2014-03-15 16:47:17
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keaikexin

新虫 (初入文坛)
这个是明场吗？
新手，第一次IF试验结果，求大神分析-2
3.15a.jpg
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4楼2014-03-15 17:09:14
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keaikexin

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by sageyaya at 2014-03-15 14:50:50
建议你下次拍的时候可以拍一个明场，这样可以对照出DAPI的那一片是单个细胞还是细胞碎片，至于绿色，我认为应该是你调的曝光时间过长，可以短一点，背景暗一点，这样细胞就会亮一些，不过我觉得既然是膜蛋白，感觉是 ...

膜蛋白染出来应该怎么样啊？
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5楼2014-03-15 18:08:29
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梅花飞飞

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
137167741: 金币+2, 鼓励交流~~ 2014-03-18 08:46:58
keaikexin: 金币+6, ★★★★★最佳答案, 谢谢~~~ 2014-03-19 19:03:25
你是刚接触细胞吧？
你的图有几个问题：
1、放大倍数太小；
2、如楼上所说，绿色背景是曝光时间的问题；
3、细胞区域选择不好，最好不要选择这种有很多聚集在一起的细胞，这些细胞已经凋亡或接近凋亡，你要选那些分散的，像你自己说的，要平铺贴壁的细胞；
4、就你给出的荧光图看，膜蛋白没有标记到，起码是标记量很小。
建议：如上，先把你买的抗体标记的protocol看好，一步一步来做；成像时，放大倍数，最好到100x，至少也有个60x的；然后你再调整曝光时间，看能不能得到更好一点的图。
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牛人是啥？
6楼2014-03-18 03:58:31
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c_jade

新虫 (初入文坛)
有时候模糊也可能是焦距没对好啊tx
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7楼2014-03-18 15:03:44
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

绿色荧光较弱，所以背景色就明显了。
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8楼2014-03-19 10:18:02
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20092210

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-03-19 10:18:02
绿色荧光较弱，所以背景色就明显了。

没有标记到或者表达低。
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9楼2014-03-19 11:20:53
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keaikexin

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 梅花飞飞 at 2014-03-18 03:58:31
你是刚接触细胞吧？
你的图有几个问题：
1、放大倍数太小；
2、如楼上所说，绿色背景是曝光时间的问题；
3、细胞区域选择不好，最好不要选择这种有很多聚集在一起的细胞，这些细胞已经凋亡或接近凋亡，你要选那 ...

恩恩，刚接触细胞，我再努力努力
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10楼2014-03-19 19:04:31
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