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CJNicolas

银虫 (初入文坛)

[求助] 大神帮忙看看原核表达的结果。。。咋这样? 已有2人参与

最近一直在做原核表达,结果让我都快疯了。。。
我做的这个基因很多前辈做了发现结果都不表达。。。导师交给我,经过分析,发现目的基因有很多稀有密码子氨基酸,随之换Rosetta菌株,发现表达结果跟以前不一样了!
请看图:左边两个相同的是不加诱导剂空白对照和空载对照,后面分别是不同IPTG浓度梯度,最后一条为Marker(质量不好,第一条90KDa的,第二条60KDa)目的蛋白64KDa
Q1:为什么加入诱导剂后,很多非目的蛋白集体边稀了?(第四孔道样品是在煮沸时进了水=_=,但是之前跑了几块的确都变稀了,所以应该不是溶液溶度被稀释的问题)
Q2:因为变得稀释,我的目的蛋白是否表达了?(与对照相比,从上往下第三条亮带,图片上对照组下面是空白的,而加诱导剂后的有一条很细的带,在一定诱导条件下有最大表达,当然   这都是我认为的)
Q3:接上问,其实肉眼可以看到空白对照有一个在我的目的蛋白大小处,有很细的一条线,但是在凝胶成像系统上,荧光照后,照片结果也看不出来,这是怎么回事?因为这个原因,更觉着目的蛋白是否表达了。
求大神赐教。。。。。。
多谢~

大神帮忙看看原核表达的结果。。。咋这样?
IMG_20140314_140608.jpg
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luwei13566

木虫 (正式写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by CJNicolas at 2014-05-12 10:05:20
对照也是Rosseta菌株,一个是空载对照(转PET30空载),一个是未加诱导剂对照(这怎么能加IPTG?)
嗯,已经发现没表达,在试别的方法,想做全基因合成优化密码子...

空载对照只要保证扩培和诱导过程中条件一致就可以,不加诱导剂的对照因为最后菌体的OD值差别很大还要稀释所以一般不需要这个对照。
至于你说的诱导和对照比背景蛋白条带集体变浅,而且IPTG浓度从左到右条带依次变深,这估计是一开始接种量不太一样或者培养条件不太相同导致的菌体OD不一样,最后破碎效果也不一样导致的
大家相互帮助哈
7楼2014-05-12 13:50:59
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查看全部 8 个回答

liu208xj

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
CJNicolas: 金币+3, 有帮助, 至少有个懂的回答了一下我的疑惑,结果是没表达。。。 2014-03-16 14:19:45
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流! 2014-03-31 19:01:18
1)从图上看,目的基因没有得到成功表达;
2)可以设计融合蛋白进行表达,再经过纯化浓缩后跑胶检测
3)可以考虑密码子优化
2楼2014-03-15 18:29:02
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CJNicolas

银虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by liu208xj at 2014-03-15 18:29:02
1)从图上看,目的基因没有得到成功表达;
2)可以设计融合蛋白进行表达,再经过纯化浓缩后跑胶检测
3)可以考虑密码子优化

请教一下,能否继续给些指导。。。。
是蛋白分子太大要拆开吗?我的稀有氨基酸分析结果显示,有一个2连的稀有密码子,而菌株Rosetta只能提供一种富含的稀有密码子,考虑优化大致要怎么做?您有做过吗?
3楼2014-03-16 14:19:11
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liu208xj

金虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by CJNicolas at 2014-03-16 14:19:11
请教一下,能否继续给些指导。。。。
是蛋白分子太大要拆开吗?我的稀有氨基酸分析结果显示,有一个2连的稀有密码子,而菌株Rosetta只能提供一种富含的稀有密码子,考虑优化大致要怎么做?您有做过吗?...

把另外一个稀有密码子进行定点突变后换成简并密码子
4楼2014-05-11 10:52:10
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