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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » 大神帮忙看看原核表达的结果。。。咋这样？
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CJNicolas

银虫 (初入文坛)

[求助] 大神帮忙看看原核表达的结果。。。咋这样？ 已有2人参与

最近一直在做原核表达，结果让我都快疯了。。。
我做的这个基因很多前辈做了发现结果都不表达。。。导师交给我，经过分析，发现目的基因有很多稀有密码子氨基酸，随之换Rosetta菌株，发现表达结果跟以前不一样了！
请看图：左边两个相同的是不加诱导剂空白对照和空载对照，后面分别是不同IPTG浓度梯度，最后一条为Marker（质量不好，第一条90KDa的，第二条60KDa）目的蛋白64KDa
Q1：为什么加入诱导剂后，很多非目的蛋白集体边稀了？（第四孔道样品是在煮沸时进了水=_=，但是之前跑了几块的确都变稀了，所以应该不是溶液溶度被稀释的问题）
Q2：因为变得稀释，我的目的蛋白是否表达了？（与对照相比，从上往下第三条亮带，图片上对照组下面是空白的，而加诱导剂后的有一条很细的带，在一定诱导条件下有最大表达，当然   这都是我认为的）
Q3：接上问，其实肉眼可以看到空白对照有一个在我的目的蛋白大小处，有很细的一条线，但是在凝胶成像系统上，荧光照后，照片结果也看不出来，这是怎么回事？因为这个原因，更觉着目的蛋白是否表达了。
求大神赐教。。。。。。
多谢~

大神帮忙看看原核表达的结果。。。咋这样？
IMG_20140314_140608.jpg
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1楼 2014-03-14 19:40:27
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liu208xj

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
CJNicolas: 金币+3, ★有帮助, 至少有个懂的回答了一下我的疑惑，结果是没表达。。。 2014-03-16 14:19:45
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-03-31 19:01:18
1)从图上看，目的基因没有得到成功表达；
2）可以设计融合蛋白进行表达，再经过纯化浓缩后跑胶检测
3）可以考虑密码子优化
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2楼2014-03-15 18:29:02
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CJNicolas

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by liu208xj at 2014-03-15 18:29:02
1)从图上看，目的基因没有得到成功表达；
2）可以设计融合蛋白进行表达，再经过纯化浓缩后跑胶检测
3）可以考虑密码子优化

请教一下，能否继续给些指导。。。。
是蛋白分子太大要拆开吗？我的稀有氨基酸分析结果显示，有一个2连的稀有密码子，而菌株Rosetta只能提供一种富含的稀有密码子，考虑优化大致要怎么做？您有做过吗？
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3楼2014-03-16 14:19:11
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liu208xj

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by CJNicolas at 2014-03-16 14:19:11
请教一下，能否继续给些指导。。。。
是蛋白分子太大要拆开吗？我的稀有氨基酸分析结果显示，有一个2连的稀有密码子，而菌株Rosetta只能提供一种富含的稀有密码子，考虑优化大致要怎么做？您有做过吗？...

把另外一个稀有密码子进行定点突变后换成简并密码子
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4楼2014-05-11 10:52:10
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
kx444555: 金币+4, 鼓励交流 2014-05-12 09:34:03
CJNicolas: 金币+4, ★有帮助, 感谢回复！ 2014-05-12 10:05:44
Q1：左边两个对照你是怎么做的？菌体扩培后没有加IPTG吗？如果没有加的话你的这两个对照就不能用，因为你的对照的发酵条件和你的实验菌株完全不一样。
Q2：你先做好对照再来讨论是否表达。~从图上看没有表达的概率很大。
Q3：同上~~如果成功表达了，目标处会很明显的。建议你看看成功用Rosetta菌株表达的文献，条件再摸索一下，真不行就得密码子优化了
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大家相互帮助哈
5楼2014-05-11 13:38:47
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CJNicolas

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-05-11 13:38:47
Q1：左边两个对照你是怎么做的？菌体扩培后没有加IPTG吗？如果没有加的话你的这两个对照就不能用，因为你的对照的发酵条件和你的实验菌株完全不一样。
Q2：你先做好对照再来讨论是否表达。~从图上看没有表达的概率 ...

对照也是Rosseta菌株，一个是空载对照（转PET30空载），一个是未加诱导剂对照（这怎么能加IPTG？）
嗯，已经发现没表达，在试别的方法，想做全基因合成优化密码子
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6楼2014-05-12 10:05:20
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luwei13566

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by CJNicolas at 2014-05-12 10:05:20
对照也是Rosseta菌株，一个是空载对照（转PET30空载），一个是未加诱导剂对照（这怎么能加IPTG？）
嗯，已经发现没表达，在试别的方法，想做全基因合成优化密码子...

空载对照只要保证扩培和诱导过程中条件一致就可以，不加诱导剂的对照因为最后菌体的OD值差别很大还要稀释所以一般不需要这个对照。
至于你说的诱导和对照比背景蛋白条带集体变浅，而且IPTG浓度从左到右条带依次变深，这估计是一开始接种量不太一样或者培养条件不太相同导致的菌体OD不一样，最后破碎效果也不一样导致的
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大家相互帮助哈
7楼2014-05-12 13:50:59
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快乐农夫

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
gyesang: 金币+4, 鼓励回帖交流！ 2014-05-31 16:11:14
肯定没有诱导出来，诱导出来的标志是0小时没有，就是不加诱导剂之前目的大小出没有条带，加诱导剂之后出现条带且越来越浓，是非常明显的，所谓的细细一条线之类的都不算。给你个建议，不要只在表达菌株上找问题，换表达载体，我的一个基因就是，PGEX载体和PET32a载体都诱导不出来，换了PET30a载体之后很快就出来了，还有，你要实在不甘心，可以转膜做个Western blot，用载体上的标签抗体检测下，不过看你的图，我估计够呛
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8楼2014-05-12 19:31:21
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