应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 眼含热泪求助：pcDNA3.1 插入4000bp 质粒构建，大虾请留步
51/1返回列表
查看: 3046  |  回复: 6
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

15944682692

新虫 (初入文坛)

[求助] 眼含热泪求助：pcDNA3.1 插入4000bp 质粒构建，大虾请留步 已有2人参与

各位大虾，兄弟最近忙于质粒构建，意图将一段长约4000+ bp的片段，通过Not1和EcoR1两个酶切位点连接到pcDNA3.1+载体上。情况如下：
1. 通过inversion AccuPrimeTaq DNA Polymerase High Fidelity酶扩增，并纯化回收目的片段（引物加酶切位点，保护性碱基，T7启动子）；由于回收效率很高150ng/ul，下一步双酶切时，NEB双酶切50ul体系，加了7 μl的目的片段*5，22℃12h,再进行胶回收。
2. 载体pcDNA3.1也按照以上的体系进行双酶切，时间为12 h,这次没有去磷酸化，（之前有过，也没连上）。
3. 将酶切后的目的片段和载体进行电泳，结果显示大小与预期相符，亮度相近。
4. 连接时，NEB T4连接酶，目的片段：载体=5：1，10 μl体系。
5. 感受态为新买的天根的DH5α。
结果：
转化后，平板上均有数量不等的菌落产生，少时10个，多时50来个。摇菌扩增8 h，提取质粒，检测组无阳性结果，有的在1000 bp左右出现条带，有的在鱼对照未酶切pCDNA3.1质粒相同位置2500左右出现条带。实验三个月无进展。
请高手指点迷津。
如果有效果好的、适于长片段连接的方法，也请大家指教，多谢。
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2014-02-25 08:30:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 15944682692 at 2014-02-25 09:10:01
非常感谢您的回复，我也尝试过连接Ｔ载体，试过很多次，但都没成功，是不是因为片段太大了连不上呢，T：1ul,片段：4ul,solutionI：5ul。16℃过夜，一般都是自连，没连上过，您还有什么好建议吗？...

这步不加T4酶能连上吗
赞一下 回复此楼
5楼2014-02-25 10:01:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 7 个回答

shiyiyaya

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1. 可考虑将PCR产物连接到T vector，这样减少你PCR的次数。日后摇菌可扩增，还可以看到酶切干净的条带，不必担心PCR产物酶切不完全。
2. 连接之前，载体少加一些，外源基因可多加，比例可10:1~15:1。体系可扩大到15ul左右。
3.可连接16° 8h左右或者室温连接3h。
4. 如果成功率不高，可挑12-24个菌提取质粒鉴定。

祝好！本人最近也遇到难题，慢慢攻克中。加油啊！
赞一下 回复此楼
2楼2014-02-25 08:38:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

15944682692

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by shiyiyaya at 2014-02-25 08:38:13
1. 可考虑将PCR产物连接到T vector，这样减少你PCR的次数。日后摇菌可扩增，还可以看到酶切干净的条带，不必担心PCR产物酶切不完全。
2. 连接之前，载体少加一些，外源基因可多加，比例可10:1~15:1。体系可扩大到1 ...

非常感谢您的回复，我也尝试过连接Ｔ载体，试过很多次，但都没成功，是不是因为片段太大了连不上呢，T：1ul,片段：4ul,solutionI：5ul。16℃过夜，一般都是自连，没连上过，您还有什么好建议吗？
赞一下 回复此楼
3楼2014-02-25 09:10:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shiyiyaya

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 15944682692 at 2014-02-25 09:10:01
非常感谢您的回复，我也尝试过连接Ｔ载体，试过很多次，但都没成功，是不是因为片段太大了连不上呢，T：1ul,片段：4ul,solutionI：5ul。16℃过夜，一般都是自连，没连上过，您还有什么好建议吗？...

如果是自连的情况多，可以考虑在连接之前进行脱磷处理。也可以尝试转化过程中的慢摇在28°左右进行，后续培养菌也在28°左右。
赞一下 回复此楼
4楼2014-02-25 09:50:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 7 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 【考研调剂】化学专业 281分，一志愿四川大学，诚心求调剂 +4 吃吃吃才有意义 2026-03-19 4/200 2026-03-19 13:48 by houyaoxu
[考研] 一志愿吉林大学材料学硕321求调剂 +6 Ymlll 2026-03-18 9/450 2026-03-19 10:28 by 星空星月
[教师之家] 焦虑 +9 水冰月月野兔 2026-03-13 13/650 2026-03-19 09:50 by otani
[考研] 304求调剂 +6 司空. 2026-03-18 6/300 2026-03-18 23:03 by 星空星月
[考研] 一志愿华中科技大学，080502，354分求调剂 +4 守候夕阳CF 2026-03-18 4/200 2026-03-18 22:16 by li123456789.
[考研] 330求调剂 +3 小材化本科 2026-03-18 3/150 2026-03-18 21:55 by 无懈可击111
[考研] 085601专硕，总分342求调剂，地区不限 +5 share_joy 2026-03-16 5/250 2026-03-18 14:48 by haxia
[考研] 311求调剂 +11 冬十三 2026-03-15 12/600 2026-03-18 14:36 by 星空星月
[考博] 环境领域全国重点实验室招收博士1-2名 +3 QGZDSYS 2026-03-13 5/250 2026-03-18 11:13 by QGZDSYS
[考博] 26博士申请 +3 1042136743 2026-03-17 3/150 2026-03-17 23:30 by 轻松不少随
[考研] 考研求调剂 +3 橘颂. 2026-03-17 4/200 2026-03-17 21:43 by 有只狸奴
[考研] 268求调剂 +7 好运连绵不绝 2026-03-12 8/400 2026-03-17 20:28 by xilongliang
[考研] 290求调剂 +3 p asserby. 2026-03-15 4/200 2026-03-17 16:35 by wangkm
[考研] 一志愿苏州大学材料工程（085601）专硕有科研经历三项国奖两个实用型专利一项省级立项 +6 大火山小火山 2026-03-16 8/400 2026-03-17 15:05 by 无懈可击111
[考研] 考研调剂 +3 淇ya_~ 2026-03-17 5/250 2026-03-17 09:25 by Winj1e
[考研] 285求调剂 +6 ytter 2026-03-12 6/300 2026-03-16 15:05 by njzyff
[考研] 327求调剂 +6 拾光任染 2026-03-15 11/550 2026-03-15 22:47 by 拾光任染
[考研] 294求调剂 +3 Zys010410@ 2026-03-13 4/200 2026-03-15 10:59 by zhq0425
[考研] 中科大材料与化工319求调剂 +3 孟鑫材料 2026-03-14 3/150 2026-03-14 20:10 by ms629
[考研] 308求调剂 +3 是Lupa啊 2026-03-12 3/150 2026-03-13 14:30 by 求调剂zz
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭