| 查看: 3090 | 回复: 6 | ||
[求助]
眼含热泪求助：pcDNA3.1 插入4000bp 质粒构建，大虾请留步 已有2人参与
|
|
各位大虾，兄弟最近忙于质粒构建，意图将一段长约4000+ bp的片段，通过Not1和EcoR1两个酶切位点连接到pcDNA3.1+载体上。情况如下： 1. 通过inversion AccuPrimeTaq DNA Polymerase High Fidelity酶扩增，并纯化回收目的片段（引物加酶切位点，保护性碱基，T7启动子）；由于回收效率很高150ng/ul，下一步双酶切时，NEB双酶切50ul体系，加了7 μl的目的片段*5，22℃12h,再进行胶回收。 2. 载体pcDNA3.1也按照以上的体系进行双酶切，时间为12 h,这次没有去磷酸化，（之前有过，也没连上）。 3. 将酶切后的目的片段和载体进行电泳，结果显示大小与预期相符，亮度相近。 4. 连接时，NEB T4连接酶，目的片段：载体=5：1，10 μl体系。 5. 感受态为新买的天根的DH5α。 结果： 转化后，平板上均有数量不等的菌落产生，少时10个，多时50来个。摇菌扩增8 h，提取质粒，检测组无阳性结果，有的在1000 bp左右出现条带，有的在鱼对照未酶切pCDNA3.1质粒相同位置2500左右出现条带。实验三个月无进展。 请高手指点迷津。 如果有效果好的、适于长片段连接的方法，也请大家指教，多谢。 |
回复此楼» 猜你喜欢
留学--博士招生
已经有16人回复
-
化学工程，本211，求调剂，ab区不限
已经有4人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有269人回复
-
湖北师范大学招调剂啦
已经有9人回复
-
邵阳学院食品与化学工程学院硕士调剂
已经有0人回复
-
天津商业大学 生物与医药课题组招生
已经有0人回复
-
生物化工学硕招收调剂
已经有0人回复
-
广东石油化工学院2026年硕士研究生需要多名生物，制药工程，食品专业的调剂生
已经有0人回复
-
317分 一志愿江南大学 化学工程学硕 求调剂
已经有6人回复
-
化工申博
已经有3人回复
shiyiyaya
金虫 (正式写手)
- 应助: 36 (小学生)
- 金币: 1276.4
- 散金: 279
- 红花: 8
- 帖子: 301
- 在线: 63.2小时
- 虫号: 871992
- 注册: 2009-10-14
- 性别: GG
- 专业: 病毒学
2楼2014-02-25 08:38:13
3楼2014-02-25 09:10:01
shiyiyaya
金虫 (正式写手)
- 应助: 36 (小学生)
- 金币: 1276.4
- 散金: 279
- 红花: 8
- 帖子: 301
- 在线: 63.2小时
- 虫号: 871992
- 注册: 2009-10-14
- 性别: GG
- 专业: 病毒学
4楼2014-02-25 09:50:46
鬼羽帝魂
木虫 (著名写手)
- 应助: 183 (高中生)
- 金币: 3100.2
- 散金: 19
- 红花: 12
- 帖子: 1427
- 在线: 186.8小时
- 虫号: 2538789
- 注册: 2013-07-09
- 专业: 生物物理、生物化学与分子
5楼2014-02-25 10:01:23
6楼2014-02-25 10:15:04
7楼2014-02-25 13:05:09
100