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眼含热泪求助：pcDNA3.1 插入4000bp 质粒构建，大虾请留步已有2人参与
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各位大虾，兄弟最近忙于质粒构建，意图将一段长约4000+ bp的片段，通过Not1和EcoR1两个酶切位点连接到pcDNA3.1+载体上。情况如下： 1. 通过inversion AccuPrimeTaq DNA Polymerase High Fidelity酶扩增，并纯化回收目的片段（引物加酶切位点，保护性碱基，T7启动子）；由于回收效率很高150ng/ul，下一步双酶切时，NEB双酶切50ul体系，加了7 μl的目的片段*5，22℃12h,再进行胶回收。 2. 载体pcDNA3.1也按照以上的体系进行双酶切，时间为12 h,这次没有去磷酸化，（之前有过，也没连上）。 3. 将酶切后的目的片段和载体进行电泳，结果显示大小与预期相符，亮度相近。 4. 连接时，NEB T4连接酶，目的片段：载体=5：1，10 μl体系。 5. 感受态为新买的天根的DH5α。 结果： 转化后，平板上均有数量不等的菌落产生，少时10个，多时50来个。摇菌扩增8 h，提取质粒，检测组无阳性结果，有的在1000 bp左右出现条带，有的在鱼对照未酶切pCDNA3.1质粒相同位置2500左右出现条带。实验三个月无进展。 请高手指点迷津。 如果有效果好的、适于长片段连接的方法，也请大家指教，多谢。 |
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