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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 细胞科学 » 交流毒素在细胞膜受体的钓选
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seasonin

银虫 (小有名气)

[交流] 交流毒素在细胞膜受体的钓选

实验思路：现制备有杀虫蛋白A，想探究其对昆虫中肠细胞的毒杀机制，依据苏云金芽胞杆菌的抗虫作用，猜想杀虫蛋白A借助昆虫中肠细胞膜的特异受体，通过信号传导或转入细胞后修饰等进入细胞，发挥毒力。借助蛋白-蛋白之间的相互作用寻找目的蛋白的受体，亦或其它方法证明蛋白之间的相互作用并找到对应的受体分子。
瓶颈有：1.大量收集细胞后，提取细胞膜需要保证细胞膜的蛋白完整。
              2.采用免疫共沉淀钓取受体，输入输出要如何设置才能保证实验数据可靠。
目前我已经做过IP和pulldown，效果都不好。  
如果大家有更好的思路或者具体的文献方法指导，感激不尽

[ Last edited by silicare on 2014-2-18 at 08:15 ]
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1楼 2014-02-09 15:42:11
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userhung

禁虫 (文学泰斗)
帮顶，blessing, blessing, blessing ! ~~~
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2楼2014-02-09 15:56:55
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seasonin

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by userhung at 2014-02-09 15:56:55
帮顶，blessing, blessing, blessing ! ~~~

thanks
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3楼2014-02-09 16:35:10
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seasonin

银虫 (小有名气)
★
137167741: 金币+1, 鼓励交流~~ 2014-02-15 21:35:15
用NP40+cocktail处理细胞后，冰上裂解，离心后取上清（膜蛋白、胞浆蛋白等），与His-beads做pre-clear，接着取上清，与蛋白A孵育，然后将（蛋白A+上清）与His-beads孵育，之后上样buffer处理后SDS-PAGE检测
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4楼2014-02-10 09:47:15
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seasonin

银虫 (小有名气)
SDS-PAGE显示，与对照相比，实验组并未多出任何条带，不知道是蛋白之间作用力太弱没拉下目的带还是其它原因
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5楼2014-02-10 09:49:16
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seasonin

银虫 (小有名气)
★
137167741: 金币+1, 鼓励交流~~ 2014-02-15 21:35:35
目前我有几个疑问
1.提蛋白膜的方法是否合适？
2.如何确定细胞膜上就存在目的蛋白的受体？确定之后如何鉴定到具体的蛋白？
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6楼2014-02-10 09:52:02
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zdfang83

木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
137167741: 金币+1, 鼓励交流~~ 2014-02-15 21:35:26
我准备做的实验和你的原理类似，可以交流一下不？
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7楼2014-02-14 16:35:43
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seasonin

银虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by zdfang83 at 2014-02-14 16:35:43
我准备做的实验和你的原理类似，可以交流一下不？

你有什么想法呢？我只是觉得这么从膜上找受体要冒很大风险，炮灰率极大，又没有摸透要怎么往下做
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8楼2014-02-15 15:06:03
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seasonin

银虫 (小有名气)
帖子没有人回答，我查过一些寻找受体的文章，在炭疽杆菌的毒素受体寻找时，毒素与细胞膜上受体结合的细胞株死亡。作者突变了细胞株CHO，90%细胞死亡，将毒素施与突变细胞株，存活细胞株为实验组，死亡细胞株为对照
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9楼2014-02-17 08:55:46
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seasonin

银虫 (小有名气)
内容已删除
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10楼2014-03-03 10:59:03
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