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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » 蛋白SDSPAGE电泳遇到分子量漂移，变大30多kDa!
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wangdunzju

新虫 (小有名气)

[求助] 蛋白SDSPAGE电泳遇到分子量漂移，变大30多kDa! 已有1人参与

最近在做蛋白的SDS-PAGE电泳，遇到目的蛋白分子量漂移的现象，请各位大侠给鉴定一下原因：
我的目的蛋白等电点为7.2，基因序列已知，可以预测其分子量为42kDa左右。用TCA-丙酮沉淀法提取总蛋白做WB检验后，证明蛋白分子量与预测的一致。
因为后面要做一些与功能相关的实验，想用可溶的体系提取蛋白。
我于是用不同pH值的提取液（Tris体系），分为5,7,9三个PH梯度分别提取烟草叶片蛋白，四度离心15分钟（13000rpm），然后将每个样品的上清（可溶性组分）与沉淀组分（不溶性组分）分别制样，用于WB检测，结果如下：蛋白SDSPAGE电泳遇到分子量漂移，变大30多kDa!
如图，TCA法杂出42kDa的目的条带，与预测分子量一致；而上清组分中没有杂出目的条带；沉淀组分中在高pH提取液样品中杂出一个约70kDa的目的带！这让我很纠结，怎么分子量会变大呢？蛋白二聚体应该不可能，因为是SDS-page电泳，SDS会打断亚基之间的结构，况且制样时用上样缓冲液煮过10分钟。那么是什么原因使蛋白的表观分子量变大了呢？我怀疑是是不是蛋白与核酸结合导致蛋白跑慢了，但不知道SDS-page电泳会不会导致核酸与蛋白的结合被破坏，所以不敢下这个结论。或者还有什么别的什么因素导致这样的结果？有这方面经验的虫友帮忙诊断一下啊！多谢了！
祝虫友马年有一切！

[ Last edited by wangdunzju on 2014-2-9 at 15:21 ]
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1楼 2014-02-09 15:18:40
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wangdunzju

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2014-02-10 13:56:40
SDS上样缓冲液是否加了巯基乙醇或者DTT？核酸蛋白复合物在SDS作用下一般会被打断。如果你不能确定，可以用核酸酶消化样品后与未做消化的比较。...

SDS上样缓冲液已经含有巯基乙醇和SDS了，既然核酸蛋白复合物在SDS作用下一般会被打断，那看来这个蛋白结合的不是核酸了？
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5楼2014-02-11 10:55:41
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Allen206

银虫 (小有名气)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-02-12 13:43:09
先别砖模，先用考染看一下，排除砖模过程不确定性，tris提取时怎么做的？不肯能无端变大，无非是聚合的问题，还原非还原都跑一下，这有篇文献TCA-丙酮沉淀法提取聚合草叶蛋白的研究董双涛  李宝霞  霍乃蕊
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不想说什么，，，，
8楼2014-02-12 11:07:14
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普通回帖

wangdunzju

新虫 (小有名气)
有没有遇到过这样情况的大侠帮忙解答啊！！！
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2楼2014-02-10 10:03:38
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-02-11 15:19:10
引用回帖:
2楼: Originally posted by wangdunzju at 2014-02-10 10:03:38
有没有遇到过这样情况的大侠帮忙解答啊！！！

SDS上样缓冲液是否加了巯基乙醇或者DTT？核酸蛋白复合物在SDS作用下一般会被打断。如果你不能确定，可以用核酸酶消化样品后与未做消化的比较。
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wangdunzju
3楼2014-02-10 13:56:40
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)
你用TCA方法是怎么提取蛋白质的啊？
我一直用RIPA裂解液提取蛋白质，有一种蛋白在做WB时总是分子量比序列估计值大20多kDa。
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4楼2014-02-11 10:52:04
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wangdunzju

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-02-11 10:52:04
你用TCA方法是怎么提取蛋白质的啊？
我一直用RIPA裂解液提取蛋白质，有一种蛋白在做WB时总是分子量比序列估计值大20多kDa。

就是用常规的TCA-丙酮沉淀法，用10%TCA磨样，离心，用丙酮洗沉淀，然后干燥，最后用尿素溶解沉淀，离心，上清制样跑SDS-PAGE。用这种方法提的蛋白样，分析量没有漂移，就是预测的43kDa。真是奇怪！
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6楼2014-02-11 10:58:50
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farther1990

铜虫 (初入文坛)
弱弱的问一声，你是怎么做到让这些条带有各种颜色啊？我做到都是清一色的蓝色啊。
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不以物喜，不以己悲
7楼2014-02-12 10:03:24
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wangdunzju

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by Allen206 at 2014-02-12 11:07:14
先别砖模，先用考染看一下，排除砖模过程不确定性，tris提取时怎么做的？不肯能无端变大，无非是聚合的问题，还原非还原都跑一下，这有篇文献TCA-丙酮沉淀法提取聚合草叶蛋白的研究董双涛  李宝霞  霍乃蕊

谢谢，我试试
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9楼2014-02-12 15:29:29
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小肥肉007

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by farther1990 at 2014-02-12 10:03:24
弱弱的问一声，你是怎么做到让这些条带有各种颜色啊？我做到都是清一色的蓝色啊。

有自带三色的预染MARKER
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10楼2014-03-19 09:46:26
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