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wangdunzju新虫 (小有名气)
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蛋白SDSPAGE电泳遇到分子量漂移，变大30多kDa! 已有1人参与
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最近在做蛋白的SDS-PAGE电泳，遇到目的蛋白分子量漂移的现象，请各位大侠给鉴定一下原因： 我的目的蛋白等电点为7.2，基因序列已知，可以预测其分子量为42kDa左右。用TCA-丙酮沉淀法提取总蛋白做WB检验后，证明蛋白分子量与预测的一致。 因为后面要做一些与功能相关的实验，想用可溶的体系提取蛋白。 我于是用不同pH值的提取液（Tris体系），分为5,7,9三个PH梯度分别提取烟草叶片蛋白，四度离心15分钟（13000rpm），然后将每个样品的上清（可溶性组分）与沉淀组分（不溶性组分）分别制样，用于WB检测，结果如下：  如图，TCA法杂出42kDa的目的条带，与预测分子量一致；而上清组分中没有杂出目的条带；沉淀组分中在高pH提取液样品中杂出一个约70kDa的目的带！这让我很纠结，怎么分子量会变大呢？蛋白二聚体应该不可能，因为是SDS-page电泳，SDS会打断亚基之间的结构，况且制样时用上样缓冲液煮过10分钟。那么是什么原因使蛋白的表观分子量变大了呢？我怀疑是是不是蛋白与核酸结合导致蛋白跑慢了，但不知道SDS-page电泳会不会导致核酸与蛋白的结合被破坏，所以不敢下这个结论。或者还有什么别的什么因素导致这样的结果？有这方面经验的虫友帮忙诊断一下啊！多谢了！ 祝虫友马年有一切！ [ Last edited by wangdunzju on 2014-2-9 at 15:21 ] |
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SDS上样缓冲液是否加了巯基乙醇或者DTT？核酸蛋白复合物在SDS作用下一般会被打断。如果你不能确定，可以用核酸酶消化样品后与未做消化的比较。 |
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