| 查看: 1983 | 回复: 11 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
皇猪木虫 (正式写手)
|
[求助]
基因克隆流程 已有1人参与
|
|
|
春节来了，本人给大家先拜个年，祝大家马年马上有车，马上有房，马上有对象，马上有金山。。。。。。 各位学者， 本人最近需要对100bp左右的PCR扩增产物测序，按照测序公司的要求，做了基因克隆，第一次做克隆吧，测序出来的结果显示 序列有920bp，远大于我的目的片段，而且测出的序列也不是我需要的，因年底从实验室回家了，这个问题还没有进行多深的探讨，想在小木虫 论坛上咨询咨询做过克隆测序的前辈，为了实现测序目的该怎么做基因克隆，具体流程怎样？？？？ 再次向大家拜年，祝大家新年快乐，阖家欢乐！！！ |
回复此楼» 猜你喜欢
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有207人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
-
氢氧化钾活化操作
已经有18人回复
-
散金
已经有68人回复
-
生物质超级电容器
已经有0人回复
daniel1112
金虫 (小有名气)
- 应助: 7 (幼儿园)
- 金币: 1035.4
- 红花: 1
- 帖子: 130
- 在线: 168.6小时
- 虫号: 3517903
- 注册: 2014-11-04
- 性别: GG
- 专业: 生物信息学
12楼2015-01-16 11:05:52
Lau_Kimura
铁虫 (正式写手)
- 应助: 41 (小学生)
- 金币: 20.5
- 散金: 189
- 红花: 19
- 帖子: 320
- 在线: 119.1小时
- 虫号: 2468570
- 注册: 2013-05-17
- 性别: GG
- 专业: 作物分子育种
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+5, 鼓励交流 2014-01-30 08:03:17
皇猪: 金币+3, ★★★很有帮助 2014-02-01 22:43:12
皇猪: 金币+3, ★★★很有帮助 2014-02-02 13:21:04
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+5, 鼓励交流 2014-01-30 08:03:17
皇猪: 金币+3, ★★★很有帮助 2014-02-01 22:43:12
皇猪: 金币+3, ★★★很有帮助 2014-02-02 13:21:04
|
最简单的TA克隆（Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A） Taq酶PCR，电泳检测产物特异性（如有必要，切胶回收），异丙醇沉淀纯化； 连接：Takara 的 pMD 18-T Vector试剂盒； 电击转化：取1-1.5微升重组质粒，40微升分装的E.coli感受态，1100V，200欧姆（1mm电击杯）； 涂板：2倍YT培养基（1mL）复苏30min后，取100微升涂布抗性筛选平板； 摇菌：挑取单菌落加入抗性LB培养基中，摇菌过夜； PCR检测：粗提质粒（200微升沉淀，加50微升水重悬浮，95度7分钟裂解，离心取2微升上清做模版）。 提质粒，消化RNA，送测序即可。 |
2楼2014-01-29 23:32:55
bujunyang
木虫 (正式写手)
卓尔不群
- 应助: 15 (小学生)
- 金币: 2600.8
- 散金: 299
- 红花: 4
- 帖子: 829
- 在线: 205.8小时
- 虫号: 808463
- 注册: 2009-07-13
- 性别: GG
- 专业: 蛋白质组学
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+5, 鼓励交流 2014-01-30 08:03:22
皇猪: 金币+3 2014-02-01 22:43:16
皇猪: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-02-02 13:20:28
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+5, 鼓励交流 2014-01-30 08:03:22
皇猪: 金币+3 2014-02-01 22:43:16
皇猪: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-02-02 13:20:28
| 建议你还是先了解一下测序原理。一个测序反应一般可以测800到1000bp。测序的结果，前边的几十个碱基和最后的几十个碱基是测不准确的，所以测序公司会建议把DNA片段连接到一个载体上去，测序反应从载体开始，这样就可以保证你的序列不会落到最前面的几十个碱基中。你需要做的是做连接和转化，挑选正确的克隆送去测序，然后从返回的结果中找到你的序列。 |
3楼2014-01-30 00:16:21
4楼2014-01-31 00:59:09
投票:
