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meimei23金虫 (著名写手)
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蔗糖致死双交换筛选 已有3人参与
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| 求助各位大神：我做棒杆菌的基因敲除，有6个基因都卡双交换子筛选这一步了，就是在单交换验证成功之后，挑菌进行蔗糖致死双交换，在蔗糖平板长出单菌落，验证时用我的敲除臂引物检测的时候能检测到目的基因缺失（只能扩到我的同源臂），但用设计的目的基因（待敲除的基因）内部引物去扩，又能扩到片段，很是郁闷！ |
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| 你所谓的只能检测到你的同源臂，不知你是怎么设计验证引物的。验证引物最直接的就是在你将要敲出的基因两端设计一对引物，用敲除菌及原始菌基因组做PCR，如果敲除了必然会比原始菌株扩增出来的短，这是最直接的证据。即使基因多拷贝了，也会出现与原始菌一样的条带，同时会有变短的条带。基因内部引物的验证只能用来自己检测用，在自己的paper中根本没有说服力的。请认真重复一下你的实验，还有敲除菌是否被原始菌或回复突变菌污染了。 |
3楼2014-01-19 21:05:25
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5楼2014-01-19 23:34:46
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非常感谢你的指导，我的同源臂引物便是如同您所描述的，就是上臂的上游和下臂的下游，如果用它来扩增原始菌株，所得到的片段应该是上下臂+目的敲除基因，双交换子完成之后，用这对引物去检测，一般会出现两种情况：1、回复突变株，扩到上下臂以及目的敲除基因；2、敲除株，只能扩到上下臂。同时设计的检测引物是根据目的基因的序列设计的一对扩增500bp的检测引物，用其检测我们所获得的敲除子，如不能扩到片段则证明目的基因已敲除。现在我遇到的问题就是，用我的上下臂引物扩增能检测到回复突变株和敲除株，然而用内部检测引物去检测敲除株是发现也能扩到片段，按常理来说，是不能扩到的，就这点非常郁闷，内部检测引物通过设置对照，已排除非特异性扩增及污染等问题，实验已重复好几遍，貌似没有多大效果，情况都一样，原始菌和回复突变菌污染的问题倒是没有想过，谢谢您！ |
6楼2014-01-19 23:58:44
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