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meimei23

金虫 (著名写手)

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[求助] 蔗糖致死双交换筛选已有3人参与

求助各位大神：我做棒杆菌的基因敲除，有6个基因都卡双交换子筛选这一步了，就是在单交换验证成功之后，挑菌进行蔗糖致死双交换，在蔗糖平板长出单菌落，验证时用我的敲除臂引物检测的时候能检测到目的基因缺失（只能扩到我的同源臂），但用设计的目的基因（待敲除的基因）内部引物去扩，又能扩到片段，很是郁闷！

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从基因文库中筛选到目的基因后的分析已经有10人回复

从事分子生物学的研究

1楼 2014-01-19 09:37:26

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朱多龙

木虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

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meimei23: 金币+10, ★★★很有帮助 2014-01-20 00:02:12
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-01-20 08:33:02

你所谓的只能检测到你的同源臂，不知你是怎么设计验证引物的。验证引物最直接的就是在你将要敲出的基因两端设计一对引物，用敲除菌及原始菌基因组做PCR，如果敲除了必然会比原始菌株扩增出来的短，这是最直接的证据。即使基因多拷贝了，也会出现与原始菌一样的条带，同时会有变短的条带。基因内部引物的验证只能用来自己检测用，在自己的paper中根本没有说服力的。请认真重复一下你的实验，还有敲除菌是否被原始菌或回复突变菌污染了。