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meimei23金虫 (著名写手)
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蔗糖致死双交换筛选 已有3人参与
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| 求助各位大神：我做棒杆菌的基因敲除，有6个基因都卡双交换子筛选这一步了，就是在单交换验证成功之后，挑菌进行蔗糖致死双交换，在蔗糖平板长出单菌落，验证时用我的敲除臂引物检测的时候能检测到目的基因缺失（只能扩到我的同源臂），但用设计的目的基因（待敲除的基因）内部引物去扩，又能扩到片段，很是郁闷！ |
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【答案】应助回帖
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-01-20 08:33:02
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-01-20 08:33:02
| 你所谓的只能检测到你的同源臂，不知你是怎么设计验证引物的。验证引物最直接的就是在你将要敲出的基因两端设计一对引物，用敲除菌及原始菌基因组做PCR，如果敲除了必然会比原始菌株扩增出来的短，这是最直接的证据。即使基因多拷贝了，也会出现与原始菌一样的条带，同时会有变短的条带。基因内部引物的验证只能用来自己检测用，在自己的paper中根本没有说服力的。请认真重复一下你的实验，还有敲除菌是否被原始菌或回复突变菌污染了。 |
3楼2014-01-19 21:05:25
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5楼2014-01-19 23:34:46
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