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jonew

木虫 (正式写手)

[求助] 转化问题 已有4人参与

近期，在做转化，目标片段3090，转化到PMD19-T中，链接过夜 4度，涂板，长的满满的单菌落，但是不长蓝斑，最主要的是 挑斑后也可以摇起来，但是菌液PCR，怎么也P不出来了，WHY，郁闷中，求大神，搭救中。。。。
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借口很贱，，，
1楼 2013-12-31 12:07:45
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-31 14:16:20
蓝白斑筛选要做对照，特别是没有蓝斑的时候。比方说转一个pUC19这样的质粒。
菌可以摇起来只说明有氨苄抗性，很可能是空载体。PCR用的是载体上的通用引物吗？P不出来的原因可能有多种。一个是本身没有插入，此外还可能PCR体系建立不正确，菌液过多等。需要分别设立对照来说明。
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2楼2013-12-31 13:05:51
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yujiaping1

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-31 14:16:34
首先问个问题，所谓的目标片段，用什么方法纯化的，切胶回收的，还是纯化的，我怀疑是连上的都是杂带，因为你做的片段比较长，按说白斑应该长得很少，全是篮斑比较正常。也建议你如楼上所说，做蓝白筛选的对照组，要确定其他克隆能出现篮斑。
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3楼2013-12-31 13:37:32
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jonew

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by yujiaping1 at 2013-12-31 13:37:32
首先问个问题，所谓的目标片段，用什么方法纯化的，切胶回收的，还是纯化的，我怀疑是连上的都是杂带，因为你做的片段比较长，按说白斑应该长得很少，全是篮斑比较正常。也建议你如楼上所说，做蓝白筛选的对照组，要 ...

片段是胶回收的

[ 发自小木虫客户端 ]
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借口很贱，，，
4楼2013-12-31 15:21:27
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liu2883508

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励交流！ 2013-12-31 23:56:04
jonew: 金币+10 2014-01-01 14:01:44
我觉得应该是你的抗生素过期了~或者药品的问题，因为菌液能长，P不出来，很有可能抗生素的问题~
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人生就是要不断的前进，忘掉不好的，记住好的向前行
5楼2013-12-31 17:18:00
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jonew

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by liu2883508 at 2013-12-31 17:18:00
我觉得应该是你的抗生素过期了~或者药品的问题，因为菌液能长，P不出来，很有可能抗生素的问题~

做了对照，一个涂AMP一个不涂，直接涂板感受态，加AMP的不长，不加AMP的长的很多。。。抗生素应该没有事吧？感受态是新买的
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借口很贱，，，
6楼2013-12-31 18:52:59
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
6楼: Originally posted by jonew at 2013-12-31 18:52:59
做了对照，一个涂AMP一个不涂，直接涂板感受态，加AMP的不长，不加AMP的长的很多。。。抗生素应该没有事吧？感受态是新买的...

建议LZ直接提个质粒看看，做什么菌液PCR啊,你的目标片段3000多要是连上肉眼都能看到，都不用蓝白斑筛选，随机挑几个就行
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大家相互帮助哈
7楼2014-01-01 00:14:33
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jonew

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-01-01 00:14:33
建议LZ直接提个质粒看看，做什么菌液PCR啊,你的目标片段3000多要是连上肉眼都能看到，都不用蓝白斑筛选，随机挑几个就行...

嗯嗯

[ 发自小木虫客户端 ]
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借口很贱，，，
8楼2014-01-01 12:54:38
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787719259

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-31 13:05:51
蓝白斑筛选要做对照，特别是没有蓝斑的时候。比方说转一个pUC19这样的质粒。
菌可以摇起来只说明有氨苄抗性，很可能是空载体。PCR用的是载体上的通用引物吗？P不出来的原因可能有多种。一个是本身没有插入，此外还 ...

想知道LZ现在做得怎么样了，我也是菌液pcr一直没有p出来过
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9楼2016-03-30 20:37:10
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