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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 白芨的根部内生真菌分离
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slgzht

银虫 (小有名气)

[求助] 白芨的根部内生真菌分离已有3人参与

各位同仁，这几天我在做白芨根部的内生真菌分离。分了快一个月了，还没分出来。
用的是PDA培养基，消毒时间除了酒精30s外，分别用了0.1%升汞2min、3min。4min、5min。死活啥都不长。
我都快哭了，现在都研二了，做不出还怎么毕业呀。白芨根看起来和生姜差不多。大家给个合适的消毒方法！！！
不知道是不是升汞把内生真菌杀死了，我又想用10%次氯酸钠10min试下。烦死了。
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为什么我木有红花？
1楼2013-12-21 10:22:43
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回帖置顶 ( 共有1个 )

xqxqxhxh1

捐助贵宾 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
slgzht: 金币+10, ★★★很有帮助, 感谢 2013-12-22 10:46:21
laozuzunzhe: 金币+5, good！ 2013-12-23 10:25:07
amisking: 回帖置顶 2014-01-06 18:56:53
建议有以下几个:
1. 请在你的1000mLPDA的配方中加入KH2PO4  3g; MgSO4  1.5g; 维生素B1: 10mg后再试试。因为PDA配方有两种，一种是综合性的，一种是普通的(主要成分就是马铃薯和葡萄糖)。综合性配方还是我上大学时我的老师教给我们的，比普通配方好。
2. 你在分离过程中的所有的器皿(如镊子、培养皿、烧杯、剪刀、解剖刀、棉球等)全部高压蒸汽灭菌，60摄氏度干燥后放入超净工作台，紫外灯照射杀菌后才能从包扎中取出来用。
3. 你的手在操作前一定要用75%酒精擦遍(关键)。
4. 白芨根部表面消毒时，只用75%酒精擦拭表面，不要浸泡。(消毒方法一)
5. 白芨根部表面消毒时，用75%酒精擦拭表面后，用0.1%升汞棉球擦拭表面，不要浸泡。(消毒方法二)
6. 用于分离的白芨根不能有伤口(关键)，2端的断口用上述消毒剂擦拭后，立即用无菌刀切弃。
消毒方法一和消毒方法二可以对比使用。我做过其它植物内生菌的分离以及多种植物内部组织分离，全部用的这样的方法，都能成功。但是我没有做过白芨根部内生菌的分离，所以我不能确定这方法是否对你有效，但你可以试试。另外，如果你所取的白芨根本身就没有内生菌，那你怎么分离都分不到的，不过这是我的看法，因为我毕竟对白芨这种植物不了解。
另外，对你有一个小的请求，就是: 你能否成功都反馈给我你成功与否的信息，好吗?
希望你能够成功!
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自己啥都不懂
2楼2013-12-22 07:41:52
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发酵流程卡

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

对于内生菌的分离，看能否按以下的方式做：
1），表面消毒可用10%的次氯酸钠消毒10min后，用无菌水清洗多次，取最后一次的清洗液测OD600，以无菌水作参比，OD600的值小于0.01（以实验条件而定，若实验条件允许，OD600越小越好），则说明表面微生物已清除。然后加入无菌水用研磨器研磨白芨根部，取研磨液用无菌水梯度稀释，分别接种培养，剩余研磨液冷藏。。。。。
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做最真实的自己
13楼2015-07-10 09:00:08
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陆封肆闭

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

1.取到白芨根后，自然晾干，用干纱布将表面擦净，不要用酒精、升汞，次氯酸钠这些溶液浸泡消毒，会渗进去杀死内生菌的。
2.分离时，手术刀火焰灭菌后从根表面一层一层地削，每削一刀都火焰灭菌一下，直到削到里面"干净"的部分，切取一小块，接入PDA上。
3.纯化。如果培养出现细菌、酵母、或多个真菌菌落，则需进行多次纯化，获得纯菌株，最后镜检确认一下。
这其实就是一个考验手法的操作，多做几次就行。食药用菌工作者经常对金针菇、北虫草、野生菌、菇木进行分离，难度也不小，熟能生巧，多做几次就出来了，技术都是练出来的。祝你好运！
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15楼2016-07-04 18:59:26
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tazhongren

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

消毒时间太长了，次氯酸钠3分钟以内，升汞1分半以内就够了，你这个时间都杀死了
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16楼2016-07-06 00:13:17
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wangxiaoguo

木虫 (正式写手)
首先要确定你所拿的材料是否有内生菌，并不是所有的根都有，如果是人工栽培的，那么很少能分离出来内生菌。

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202010
18楼2016-08-26 09:52:03
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普通回帖

slgzht

银虫 (小有名气)
laozuzunzhe: 编辑内容 2013-12-23 10:25
引用回帖:
2楼: Originally posted by xqxqxhxh1 at 2013-12-22 07:41:52
建议有以下几个:
1. 请在你的1000mLPDA的配方中加入KH2PO4  3g; MgSO4  1.5g; 维生素B1: 10mg后再试试。因为PDA配方有两种，一种是综合性的，一种是普通的(主要成分就是马铃薯和葡萄糖)。综合性配方还是我上大学时 ...

可以和您交流下吗？

[ Last edited by laozuzunzhe on 2013-12-23 at 10:25 ]
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为什么我木有红花？
3楼2013-12-22 10:46:54
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xqxqxhxh1

捐助贵宾 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by slgzht at 2013-12-22 10:46:54
可以和您交流下吗？
...

可以，我已经将我的所有的经验都写进了给您的回复，您先去做做看能否成功。一般的真菌在一个星期的培养中可以看到是否生长的结果，所以您先赶紧抓紧时间做一下，看能否成功。总之，请您记住一个原则，就是既要表面灭菌彻底，不能污染，也不能将根内部的菌杀死了(0.1%的升汞杀菌力极强，这我们做过实验)。如果这些都做得很好了，只要有内生菌，是肯定分离得到菌的。如果还是分离不到菌，那就是您的白芨的根内部可能没有内生菌了。如果您还有什么问题，尽可以给我留言。不过您先做做吧，光犯愁、着急没有用呀!您说是不是?
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自己啥都不懂
4楼2013-12-23 15:17:54
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slgzht

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by xqxqxhxh1 at 2013-12-23 15:17:54
可以，我已经将我的所有的经验都写进了给您的回复，您先去做做看能否成功。一般的真菌在一个星期的培养中可以看到是否生长的结果，所以您先赶紧抓紧时间做一下，看能否成功。总之，请您记住一个原则，就是既要表面 ...

这小木虫还可以屏蔽我的QQ号？厉害了。我昨天看了你的留言，下午就做好了，今天还没发现污染，但还没长出来，如果后面还是不涨的话，那就只能说明没有真菌了。太感谢你了，这几天听说开题报告和中期考核一块讲呢，这菌都分不出来，我都愁死了。
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为什么我木有红花？
5楼2013-12-23 16:19:49
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xqxqxhxh1

捐助贵宾 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by slgzht at 2013-12-23 16:19:49
这小木虫还可以屏蔽我的QQ号？厉害了。我昨天看了你的留言，下午就做好了，今天还没发现污染，但还没长出来，如果后面还是不涨的话，那就只能说明没有真菌了。太感谢你了，这几天听说开题报告和中期考核一块讲呢， ...

您昨天做的，如果有真菌的话，真菌从白芨到您配制的培养基因为前后生长环境不同，可能要两三天或更长一些的时间才能看到生长。您除了注意操作方法上既不要污染杂菌，又要保证真菌生长外，您还要考虑您分离的真菌是否有什么特别。您决定从白芨中分离真菌，一定是看到有报道才这么做，而且一定是这真菌有意义您才做。所以建议您一定要查到原始的文献，要把有关白芨内生真菌的英文文献尽量都查到，看前人用的什么培养基、什么培养条件，分离方法是否有什么特别之处等。总之，建议您要吃透英文文献的内容，否则就可能要走很多的弯路。因为我不懂白芨，也不做有关它的工作，我就只能在您等待结果的过程中给您提这样的建议。
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自己啥都不懂
6楼2013-12-23 23:09:42
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slgzht

银虫 (小有名气)
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6楼: Originally posted by xqxqxhxh1 at 2013-12-23 23:09:42
您昨天做的，如果有真菌的话，真菌从白芨到您配制的培养基因为前后生长环境不同，可能要两三天或更长一些的时间才能看到生长。您除了注意操作方法上既不要污染杂菌，又要保证真菌生长外，您还要考虑您分离的真菌是 ...

目前还没发现污染，英文文献看了，也没啥，就是PDA培养基，不过我感觉外文文献真菌培养温度是25度，而国内一般是28度。其他的倒没啥不一样。我之前做的组织块好像在4天以后出现了褐变，希望这次能早点长出来
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为什么我木有红花？
7楼2013-12-24 22:25:48
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xqxqxhxh1

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【答案】应助回帖

那您就把温度调节到英文文献上的25度，严格按照别人的条件去操作，等到4天以后看能不能长。
还有，您以前在4天以后出现了褐变，说明能长出菌，为什么后来又分离不到了呢? 您可以自己分析一下出现前后差别的原因。
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8楼2013-12-24 22:36:48
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slgzht

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by xqxqxhxh1 at 2013-12-24 22:36:48
那您就把温度调节到英文文献上的25度，严格按照别人的条件去操作，等到4天以后看能不能长。
还有，您以前在4天以后出现了褐变，说明能长出菌，为什么后来又分离不到了呢? 您可以自己分析一下出现前后差别的原因。

褐变了，但是没长出来菌。四天了，还是没长出来。
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为什么我木有红花？
9楼2013-12-25 16:25:22
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xqxqxhxh1

捐助贵宾 (著名写手)

【答案】应助回帖

我现在理解您说的"褐变"是白芨内部组织褐变，而不是长出了菌，不知道对不对? 因为我做的植物组织不发生褐变。这样看来您用的白芨内部组织似乎是没有内生菌。建议于下: 既然没有污染，继续培养至一星期，看能否长菌；同时，您想办法根据您的课题找到有内生菌的白芨继续分离，但是怎么辨认白芨是否有内生菌，因为我不了解，所以我就不懂了。
反正您都已经分离了，建议还是继续培养现有的分离组织，一星期后看有菌没有。
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自己啥都不懂
10楼2013-12-25 16:57:04
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