| 查看: 5531 | 回复: 4 | |||
| 本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看 | |||
[交流]
糊涂了，不知到底要不要考虑移码的问题？ 已有3人参与
|
|||
|
大家好，初涉质粒构建，一直被引物设计时是否应考虑移码的问题所困扰。查了坛子很多虫友们所发的帖子，觉得越来越迷糊了。我想请教各位大牛们： 1. 是不是只有在做融合蛋白时，引物设计才考虑是否移码，而非融合蛋白表达也就是做一般PCR连接载体时，不用考虑移码问题，直接设计引物，加酶切位点和保护碱基即可？如果这样的话，如果某一酶切位点识别的碱基个数为8个碱基或4个碱基，像Hae III（GGCC），Asc I （GGCGCGCC）等这样的酶切位点，并非3的整数倍，当基因阅读到酶切位点后面ATG位置时，那就并非以ATG开始翻译了，有可能移码了。是不是因为大多数位点为6个识别碱基，不用考虑移码？还是基因翻译时，直接从ATG开始，前面的酶切碱基并不会影响翻译？如果这样，融合基因又为什么要考虑移码问题？越想越糊涂，不知到底要不要考虑移码？ 2.如果酶切位点也按照3个3个的阅读，避免移码，那位点前所加的保护碱基是否也会3个3个的阅读，这样，保护碱基个数是否也应考虑进去以免移码？看过一些融合基因引物设计实例，好像都是严格从酶切位点开始防止移码，而保护碱基随便添加即可，而不用考虑移码问题，那这样的话，如果保护碱基不是3的倍数，那不也会同样发生移码吗？ 3.PCR某一CDS时，引物设计通常以ATG开始，如某一基因序列为“5’ ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC …………TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA 3”，按照互补原则，上游引物就应是“5’ TACCACTCGTTCCCGCTCCTCG3’”，下游引物是“5’ TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA3’”，这样引物就不会出现ATG开始，而是TAC开始了，是不是要从这基因的互补链为模板做设计？还是不管这些，直接按需求直接拷贝原序列最前几个碱基做上游引物，因2条链是互补，扩出产物是一样？那这样，前面所提的这一对不含ATG的引物“5’ TACCACTCGTTCCCGCTCCTCG3’”，下游引物“5’ TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA3’”能否正确扩增和翻译出目的蛋白？ 提的问题太多，困扰了很久，刚来论坛，也没多余金币赠送，但还是敬请各位牛人大侠多多指导，不胜感谢！ |
回复此楼» 猜你喜欢
留学--博士招生
已经有16人回复
-
化学工程，本211，求调剂，ab区不限
已经有4人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有227人回复
-
湖北师范大学招调剂啦
已经有7人回复
-
邵阳学院食品与化学工程学院硕士调剂
已经有0人回复
-
天津商业大学 生物与医药课题组招生
已经有0人回复
-
生物化工学硕招收调剂
已经有0人回复
-
广东石油化工学院2026年硕士研究生需要多名生物，制药工程，食品专业的调剂生
已经有0人回复
-
317分 一志愿江南大学 化学工程学硕 求调剂
已经有6人回复
-
化工申博
已经有1人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 设计原核表达引物时，要不要卡率移码的问题？
已经有8人回复
cicelyzh
铁杆木虫 (职业作家)
- MolEPI: 10
- 应助: 1662 (讲师)
- 金币: 8693.8
- 红花: 72
- 帖子: 3516
- 在线: 456小时
- 虫号: 1614001
- 注册: 2012-02-13
- 专业: 生物化学
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
amisking: 金币+3, MolEPI+1, 感谢发帖应助，帮助虫子 2013-12-15 18:14:31
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
amisking: 金币+3, MolEPI+1, 感谢发帖应助，帮助虫子 2013-12-15 18:14:31
|
1. 不做融合蛋白时的确不用考虑太多，只需要检查一下启动子下游到目的基因起始之间是否有ATG或者GTG，否则可能出现不同的翻译起始。融合基因表达当然要考虑是否移码，因为两个ORF是要连起来表达. 2. 保护碱基只是在切PCR产物时起作用，连接到载体时已经被酶切掉了。 3. 你需要稍微复习一下分子生物学基础。DNA中的模板链是与mRNA互补的，引物序列是与mRNA方向相同，也就是上游引物是5'-保护碱基-酶切位点-ATG-.......。如果反过来设计引物，没有ATG不会起始，而且也不是正确的产物。 |
2楼2013-12-15 13:06:30
3楼2013-12-15 21:25:02
sxxuan
金虫 (著名写手)
- MolEPI: 4
- 应助: 107 (高中生)
- 金币: 3442.4
- 散金: 104
- 红花: 17
- 帖子: 1478
- 在线: 266.1小时
- 虫号: 512865
- 注册: 2008-02-27
- 性别: MM
- 专业: 生物化学
4楼2013-12-17 14:08:21
chenziping
金虫 (小有名气)
- 应助: 4 (幼儿园)
- 金币: 292.1
- 散金: 11
- 红花: 4
- 帖子: 189
- 在线: 155.6小时
- 虫号: 1062485
- 注册: 2010-07-22
- 性别: GG
- 专业: 高分子合成化学
5楼2014-07-06 17:03:42
