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糊涂了，不知到底要不要考虑移码的问题？已有3人参与
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大家好，初涉质粒构建，一直被引物设计时是否应考虑移码的问题所困扰。查了坛子很多虫友们所发的帖子，觉得越来越迷糊了。我想请教各位大牛们： 1. 是不是只有在做融合蛋白时，引物设计才考虑是否移码，而非融合蛋白表达也就是做一般PCR连接载体时，不用考虑移码问题，直接设计引物，加酶切位点和保护碱基即可？如果这样的话，如果某一酶切位点识别的碱基个数为8个碱基或4个碱基，像Hae III（GGCC），Asc I （GGCGCGCC）等这样的酶切位点，并非3的整数倍，当基因阅读到酶切位点后面ATG位置时，那就并非以ATG开始翻译了，有可能移码了。是不是因为大多数位点为6个识别碱基，不用考虑移码？还是基因翻译时，直接从ATG开始，前面的酶切碱基并不会影响翻译？如果这样，融合基因又为什么要考虑移码问题？越想越糊涂，不知到底要不要考虑移码？ 2.如果酶切位点也按照3个3个的阅读，避免移码，那位点前所加的保护碱基是否也会3个3个的阅读，这样，保护碱基个数是否也应考虑进去以免移码？看过一些融合基因引物设计实例，好像都是严格从酶切位点开始防止移码，而保护碱基随便添加即可，而不用考虑移码问题，那这样的话，如果保护碱基不是3的倍数，那不也会同样发生移码吗？ 3.PCR某一CDS时，引物设计通常以ATG开始，如某一基因序列为“5’ ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC …………TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA 3”，按照互补原则，上游引物就应是“5’ TACCACTCGTTCCCGCTCCTCG3’”，下游引物是“5’ TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA3’”，这样引物就不会出现ATG开始，而是TAC开始了，是不是要从这基因的互补链为模板做设计？还是不管这些，直接按需求直接拷贝原序列最前几个碱基做上游引物，因2条链是互补，扩出产物是一样？那这样，前面所提的这一对不含ATG的引物“5’ TACCACTCGTTCCCGCTCCTCG3’”，下游引物“5’ TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA3’”能否正确扩增和翻译出目的蛋白？ 提的问题太多，困扰了很久，刚来论坛，也没多余金币赠送，但还是敬请各位牛人大侠多多指导，不胜感谢！ |
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sxxuan
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4楼2013-12-17 14:08:21
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
amisking: 金币+3, MolEPI+1, 感谢发帖应助，帮助虫子 2013-12-15 18:14:31
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amisking: 金币+3, MolEPI+1, 感谢发帖应助，帮助虫子 2013-12-15 18:14:31
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1. 不做融合蛋白时的确不用考虑太多，只需要检查一下启动子下游到目的基因起始之间是否有ATG或者GTG，否则可能出现不同的翻译起始。融合基因表达当然要考虑是否移码，因为两个ORF是要连起来表达. 2. 保护碱基只是在切PCR产物时起作用，连接到载体时已经被酶切掉了。 3. 你需要稍微复习一下分子生物学基础。DNA中的模板链是与mRNA互补的，引物序列是与mRNA方向相同，也就是上游引物是5'-保护碱基-酶切位点-ATG-.......。如果反过来设计引物，没有ATG不会起始，而且也不是正确的产物。 |
2楼2013-12-15 13:06:30
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chenziping
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