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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 基因表达的转化环节
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拜白501

新虫 (小有名气)

[求助] 基因表达的转化环节

我把感受态细胞涂在LB固体培养基的培养皿上，然后静置一小时，之后本来是要放在37度培养的，但后来放错了，放到了4度过夜，第二天早上才放到了37度培养，虽然也长出了菌落。这样放4度过夜，会影响感受态细胞的生长吗？对实验结果会有影响吗？因为我是刚学这些东西，所以也不懂！哪位高手可以指导一下啊？谢谢!
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1楼 2013-12-03 12:55:42
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bleach060452

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-03 20:25:10
没啥事的，验证一下单克隆不就得了。不放心就重新转，反正没多麻烦
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岂能尽如人意，但求无愧我心
2楼2013-12-03 16:41:02
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拜白501

新虫 (小有名气)
哦！谢谢啊！
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3楼2013-12-03 18:48:20
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拜白501

新虫 (小有名气)
我把载体连接好后，再导入感受态细胞，但由于移液枪有点问题，自己又没注意，我就感觉我没有加感受态细胞在里面，然后又在4度放了一夜，今天跑电泳居然跑出了目的条带，但是很模糊，这是为什么呢？难道就一点点的感受态细胞就能够使载体连接产物扩增了？
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4楼2013-12-03 19:16:53
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bleach060452

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-04 18:28:57
引用回帖:
4楼: Originally posted by 拜白501 at 2013-12-03 19:16:53
我把载体连接好后，再导入感受态细胞，但由于移液枪有点问题，自己又没注意，我就感觉我没有加感受态细胞在里面，然后又在4度放了一夜，今天跑电泳居然跑出了目的条带，但是很模糊，这是为什么呢？难道就一点点的感 ...

第一啊，楼主记得点“回复此楼”，要不我没法知道你给我留言了。。。

第二，你的描述太跳跃了，你的意思是说：连接产物由于移液器的问题不确定是否加入了感受态细胞，然后你进行了转化试验，涂板后虽然有操作失误（4度过夜），但37度培养后有阳性克隆。对吧？

      那么你是用什么方法验证的呢，你说说的电泳是PCR验证还是酶切验证的结果？

那么我想说几点：
1. 做实验首先要规范实验操作，要不浪费实验材料，关键是浪费你自己的宝贵时间。
   既然发现枪有问题，为什么不补加感受态细胞，为什么怀疑没加感受态还继续转化试验呢？
2. 以后转化涂板后，直接37度正置培养半小时吸收、干燥菌液后，改倒置培养。
3.虽然有系列的操作失误，但是好在没有致命性的问题，所以理论上仍然有成功的可能性，那么最后如果验证成功说明你的运气爆发了。。。这都行。。。

个人见解，仅供参考
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岂能尽如人意，但求无愧我心
5楼2013-12-04 11:38:20
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拜白501

新虫 (小有名气)
我是在冰上放了半个小时之后才发现自己的感受态细胞可能没有加进去，这种情况下我也能再补加感受态细胞吗？
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6楼2013-12-04 15:50:30
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拜白501

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by bleach060452 at 2013-12-04 11:38:20
第一啊，楼主记得点“回复此楼”，要不我没法知道你给我留言了。。。

第二，你的描述太跳跃了，你的意思是说：连接产物由于移液器的问题不确定是否加入了感受态细胞，然后你进行了转化试验，涂板后虽然有操作失 ...

我是在冰上放了半个小时之后才发现自己的感受态细胞可能没有加进去，这种情况下我也能再补加感受态细胞吗？我验证是通过PCR再电泳的！
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7楼2013-12-04 15:54:12
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bleach060452

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 拜白501 at 2013-12-04 15:54:12
我是在冰上放了半个小时之后才发现自己的感受态细胞可能没有加进去，这种情况下我也能再补加感受态细胞吗？我验证是通过PCR再电泳的！...

如果是我：还有连接产物剩余时，直接重新做转化，这样只损失半个小时，总比浪费一天好；如果连接产物都用了，那么补加感受态，重新冰浴——>转化，应该是没问题的。

既然PCR验证有条带，只要大小正确，条带单一就应该是连上了。把这个单克隆保存菌种、提质粒做酶切验证，然后测序。
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岂能尽如人意，但求无愧我心
8楼2013-12-04 17:07:54
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yyll1988

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可以的，我原先经常把转化后的菌放4℃。只要阳性克隆子验证没有问题就可以了。
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9楼2013-12-05 09:05:15
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genghan

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
转化没有实际上那么严格，37℃仅是生长最佳生长温度，4摄氏度生长极为缓慢，但希望楼主实验过程能够规范操作，避免任何非人为原因造成实验困扰。
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10楼2013-12-05 16:03:19
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