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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 分子实验遇到了瓶颈 求助！
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彭清LC

新虫 (初入文坛)

[求助] 分子实验遇到了瓶颈 求助！

我是做定点突变的
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1楼 2013-12-02 14:31:30
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彭清LC

新虫 (初入文坛)
刚刚做分子实验，有些地方可能操作不当，请大神指教！
我的载体构建成功了，双酶切的时候载体和目的基因的条带都有，设计引物做定点突变，PCR之后跑胶验证是有很亮的条带的，说明P成功了！
之后我用DpnI消化酶消化模板，操作是说明书上的：nuclease-free water 32ul/10Xbuffer tango 4ul/DNA 2ul/DpnI 1-4ul不等，之后在37摄氏度消化一个小时，80摄氏度下20min使酶失活，之后把上述50ul消化体系全部加到感受态中冰镇30min,42摄氏度90s热激转化，再在冰上静止5分钟，把转化后的感受态直接加到刷选平板上，过夜之后还是不长菌，求大神给我指导指导！
PS:我怀疑是感受态的原因，但是我的感受态没有做多久，而且做的时候验证了一下是可以用的！
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2楼2013-12-02 14:36:27
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zh10246

铁杆木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-02 20:07:30
1, 怀疑是感受态的原因,做个阳性对照；
2，之后把上述50ul消化体系全部加到感受态中，感受态细胞多少ul啊，感觉不需要50ul消化体系，加个5ul+50ul感受态细胞；
3，冰上静止5分钟后，在37摄氏度摇床摇个45分钟，再加到刷选平板上看看。
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3楼2013-12-02 18:54:39
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gu03jia

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-15 22:06:04
根据个人经验，酶切后可以电泳下检测酶切质量。连接时间可以延长，我经常冰上连接过夜，转化成功率还是很高的。转化结束后最好先在摇床上摇一个小时左右再涂平板。
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4楼2013-12-03 11:22:03
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彭清LC

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zh10246 at 2013-12-02 18:54:39
1, 怀疑是感受态的原因,做个阳性对照；
2，之后把上述50ul消化体系全部加到感受态中，感受态细胞多少ul啊，感觉不需要50ul消化体系，加个5ul+50ul感受态细胞；
3，冰上静止5分钟后，在37摄氏度摇床摇个45分钟，再 ...

感受态没什么问题，是消化的时候的消化体系有问题，加的DNA的量太少了，才转化不成功的，谢谢你
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5楼2013-12-15 21:23:56
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