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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » XhoI和NcoI双酶切之后连接转化不长克隆
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ningning915

新虫 (小有名气)

[求助] XhoI和NcoI双酶切之后连接转化不长克隆

你们好，我想请教个问题，我用的载体是pBac5，用NcoI和XhoI37℃进行双酶切（做过3次，2次过夜，一次6h），之后胶回收，目的片段是有酶切位点的退火形成的双链，之后连接，用过载体和目的片段为1:3、1:4、1:5、1:6、1:7.5、3:3、2:3的体系连接，目的片段只有50bp，只长过一次，之后再也没长过克隆是怎么回事呢？？请高手请教，谢谢！！非常的着急！！！
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1楼 2013-11-28 09:22:06
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lpzl

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2013-11-28 10:22:34
酶切体系是啥样的？
酶切是不是太久了？我用这两个酶最多也就切3h，还有酶切过后，点1-2ul电泳看看，其他的直接用PCR产物试剂盒回收，这比胶回收得率要高得多。
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Start_everyday_with_a_new_hope,_leave_bad_memories...
2楼2013-11-28 09:36:14
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ningning915

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lpzl at 2013-11-28 09:36:14
酶切体系是啥样的？
酶切是不是太久了？我用这两个酶最多也就切3h，还有酶切过后，点1-2ul电泳看看，其他的直接用PCR产物试剂盒回收，这比胶回收得率要高得多。

酶切体系质粒加了20ul，ncoi加0.5，xhoi加了0.5，bufferR（2*tango是8ul）加了4ul，水是15ul。
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3楼2013-11-28 09:46:49
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ningning915

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lpzl at 2013-11-28 09:36:14
酶切体系是啥样的？
酶切是不是太久了？我用这两个酶最多也就切3h，还有酶切过后，点1-2ul电泳看看，其他的直接用PCR产物试剂盒回收，这比胶回收得率要高得多。

但是2个酶切位点之间有191bp的碱基，这么做自连会不会太多？？
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4楼2013-11-28 09:48:37
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zh10246

铁杆木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-28 10:47:09
gyesang: 回帖置顶 2013-11-28 10:47:31
ningning915: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-11-28 11:03:50
1，做阳性对照；
2，检查你的退火后的双链是有OVERHANG的，就如酶切后的一样；
3，电泳检查你确实回收到了酶切后的载体，
4，如果再做酶切可以时间短一点，一个小时就够了，这样做克隆也快。
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5楼2013-11-28 10:07:04
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ningning915

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by zh10246 at 2013-11-28 10:07:04
1，做阳性对照；
2，检查你的退火后的双链是有OVERHANG的，就如酶切后的一样；
3，电泳检查你确实回收到了酶切后的载体，
4，如果再做酶切可以时间短一点，一个小时就够了，这样做克隆也快。

怎么检查我的退火后的双链是有OVERHANG，酶切后载体胶回收能够检测到，但是相对于目的条带比较暗，酶切一个小时会不会切不开，影响连接。阳性对照是指的转质粒么？这个我做过，长的
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6楼2013-11-28 10:31:08
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zh10246

铁杆木虫 (文坛精英)
引用回帖:
6楼: Originally posted by ningning915 at 2013-11-28 10:31:08
怎么检查我的退火后的双链是有OVERHANG，酶切后载体胶回收能够检测到，但是相对于目的条带比较暗，酶切一个小时会不会切不开，影响连接。阳性对照是指的转质粒么？这个我做过，长的...

怎么检查我的退火后的双链是有OVERHANG，就是设计两条引物的时候，退火后，末端是和酶切后突出来的一样，刚好和酶切后的载体连上，
你可以做个试验，看看一个小时是否能切开，
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7楼2013-11-28 10:38:25
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zh10246

铁杆木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

CATGGXXXXXXXC
                        CXXXXXXXGAGCT
你的退火后的序列
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8楼2013-11-28 10:45:52
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ningning915

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by zh10246 at 2013-11-28 10:45:52
CATGGXXXXXXXC
                        CXXXXXXXGAGCT
你的退火后的序列

退火后是这样的，没有错
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9楼2013-11-28 10:51:43
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zh10246

铁杆木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by ningning915 at 2013-11-28 10:51:43
退火后是这样的，没有错...

看看连接酶的BUFFER有没有问题，用新的看看
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10楼2013-11-28 10:54:45
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