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ningning915

新虫 (小有名气)


[求助] XhoI和NcoI双酶切之后连接转化不长克隆

你们好,我想请教个问题,我用的载体是pBac5,用NcoI和XhoI37℃进行双酶切(做过3次,2次过夜,一次6h),之后胶回收,目的片段是有酶切位点的退火形成的双链,之后连接,用过载体和目的片段为1:3、1:4、1:5、1:6、1:7.5、3:3、2:3的体系连接,目的片段只有50bp,只长过一次,之后再也没长过克隆是怎么回事呢??请高手请教,谢谢!!非常的着急!!!
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zh10246

铁杆木虫 (文坛精英)

引用回帖:
6楼: Originally posted by ningning915 at 2013-11-28 10:31:08
怎么检查我的退火后的双链是有OVERHANG,酶切后载体胶回收能够检测到,但是相对于目的条带比较暗,酶切一个小时会不会切不开,影响连接。阳性对照是指的转质粒么?这个我做过,长的...

怎么检查我的退火后的双链是有OVERHANG,就是设计两条引物的时候,退火后,末端是和酶切后突出来的一样,刚好和酶切后的载体连上,
你可以做个试验,看看一个小时是否能切开,
7楼2013-11-28 10:38:25
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lpzl

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2013-11-28 10:22:34
酶切体系是啥样的?
酶切是不是太久了?我用这两个酶最多也就切3h,还有酶切过后,点1-2ul电泳看看,其他的直接用PCR产物试剂盒回收,这比胶回收得率要高得多。
Start_everyday_with_a_new_hope,_leave_bad_memories...
2楼2013-11-28 09:36:14
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ningning915

新虫 (小有名气)


引用回帖:
2楼: Originally posted by lpzl at 2013-11-28 09:36:14
酶切体系是啥样的?
酶切是不是太久了?我用这两个酶最多也就切3h,还有酶切过后,点1-2ul电泳看看,其他的直接用PCR产物试剂盒回收,这比胶回收得率要高得多。

酶切体系质粒加了20ul,ncoi加0.5,xhoi加了0.5,bufferR(2*tango是8ul)加了4ul,水是15ul。
3楼2013-11-28 09:46:49
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ningning915

新虫 (小有名气)


引用回帖:
2楼: Originally posted by lpzl at 2013-11-28 09:36:14
酶切体系是啥样的?
酶切是不是太久了?我用这两个酶最多也就切3h,还有酶切过后,点1-2ul电泳看看,其他的直接用PCR产物试剂盒回收,这比胶回收得率要高得多。

但是2个酶切位点之间有191bp的碱基,这么做自连会不会太多??
4楼2013-11-28 09:48:37
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