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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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ningning915

新虫 (小有名气)


[求助] XhoI和NcoI双酶切之后连接转化不长克隆

你们好,我想请教个问题,我用的载体是pBac5,用NcoI和XhoI37℃进行双酶切(做过3次,2次过夜,一次6h),之后胶回收,目的片段是有酶切位点的退火形成的双链,之后连接,用过载体和目的片段为1:3、1:4、1:5、1:6、1:7.5、3:3、2:3的体系连接,目的片段只有50bp,只长过一次,之后再也没长过克隆是怎么回事呢??请高手请教,谢谢!!非常的着急!!!
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lpzl

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2013-11-28 10:22:34
酶切体系是啥样的?
酶切是不是太久了?我用这两个酶最多也就切3h,还有酶切过后,点1-2ul电泳看看,其他的直接用PCR产物试剂盒回收,这比胶回收得率要高得多。
Start_everyday_with_a_new_hope,_leave_bad_memories...
2楼2013-11-28 09:36:14
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ningning915

新虫 (小有名气)


引用回帖:
2楼: Originally posted by lpzl at 2013-11-28 09:36:14
酶切体系是啥样的?
酶切是不是太久了?我用这两个酶最多也就切3h,还有酶切过后,点1-2ul电泳看看,其他的直接用PCR产物试剂盒回收,这比胶回收得率要高得多。

酶切体系质粒加了20ul,ncoi加0.5,xhoi加了0.5,bufferR(2*tango是8ul)加了4ul,水是15ul。
3楼2013-11-28 09:46:49
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ningning915

新虫 (小有名气)


引用回帖:
2楼: Originally posted by lpzl at 2013-11-28 09:36:14
酶切体系是啥样的?
酶切是不是太久了?我用这两个酶最多也就切3h,还有酶切过后,点1-2ul电泳看看,其他的直接用PCR产物试剂盒回收,这比胶回收得率要高得多。

但是2个酶切位点之间有191bp的碱基,这么做自连会不会太多??
4楼2013-11-28 09:48:37
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zh10246

铁杆木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-11-28 10:47:09
gyesang: 回帖置顶 2013-11-28 10:47:31
ningning915: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-11-28 11:03:50
1,做阳性对照;
2,检查你的退火后的双链是有OVERHANG的,就如酶切后的一样;
3,电泳检查你确实回收到了酶切后的载体,
4,如果再做酶切可以时间短一点,一个小时就够了,这样做克隆也快。
5楼2013-11-28 10:07:04
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ningning915

新虫 (小有名气)


引用回帖:
5楼: Originally posted by zh10246 at 2013-11-28 10:07:04
1,做阳性对照;
2,检查你的退火后的双链是有OVERHANG的,就如酶切后的一样;
3,电泳检查你确实回收到了酶切后的载体,
4,如果再做酶切可以时间短一点,一个小时就够了,这样做克隆也快。

怎么检查我的退火后的双链是有OVERHANG,酶切后载体胶回收能够检测到,但是相对于目的条带比较暗,酶切一个小时会不会切不开,影响连接。阳性对照是指的转质粒么?这个我做过,长的
6楼2013-11-28 10:31:08
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zh10246

铁杆木虫 (文坛精英)

引用回帖:
6楼: Originally posted by ningning915 at 2013-11-28 10:31:08
怎么检查我的退火后的双链是有OVERHANG,酶切后载体胶回收能够检测到,但是相对于目的条带比较暗,酶切一个小时会不会切不开,影响连接。阳性对照是指的转质粒么?这个我做过,长的...

怎么检查我的退火后的双链是有OVERHANG,就是设计两条引物的时候,退火后,末端是和酶切后突出来的一样,刚好和酶切后的载体连上,
你可以做个试验,看看一个小时是否能切开,
7楼2013-11-28 10:38:25
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zh10246

铁杆木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

CATGGXXXXXXXC
                        CXXXXXXXGAGCT
你的退火后的序列
8楼2013-11-28 10:45:52
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ningning915

新虫 (小有名气)


引用回帖:
8楼: Originally posted by zh10246 at 2013-11-28 10:45:52
CATGGXXXXXXXC
                        CXXXXXXXGAGCT
你的退火后的序列

退火后是这样的,没有错
9楼2013-11-28 10:51:43
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zh10246

铁杆木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by ningning915 at 2013-11-28 10:51:43
退火后是这样的,没有错...

看看连接酶的BUFFER有没有问题,用新的看看
10楼2013-11-28 10:54:45
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