应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » XhoI和NcoI双酶切之后连接转化不长克隆
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
231/3返回列表123下一页
查看: 2291  |  回复: 22
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

ningning915

新虫 (小有名气)

[求助] XhoI和NcoI双酶切之后连接转化不长克隆

你们好，我想请教个问题，我用的载体是pBac5，用NcoI和XhoI37℃进行双酶切（做过3次，2次过夜，一次6h），之后胶回收，目的片段是有酶切位点的退火形成的双链，之后连接，用过载体和目的片段为1:3、1:4、1:5、1:6、1:7.5、3:3、2:3的体系连接，目的片段只有50bp，只长过一次，之后再也没长过克隆是怎么回事呢？？请高手请教，谢谢！！非常的着急！！！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-11-28 09:22:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lpzl

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2013-11-28 10:22:34
酶切体系是啥样的？
酶切是不是太久了？我用这两个酶最多也就切3h，还有酶切过后，点1-2ul电泳看看，其他的直接用PCR产物试剂盒回收，这比胶回收得率要高得多。
赞一下 回复此楼
Start_everyday_with_a_new_hope,_leave_bad_memories...
2楼2013-11-28 09:36:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ningning915

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lpzl at 2013-11-28 09:36:14
酶切体系是啥样的？
酶切是不是太久了？我用这两个酶最多也就切3h，还有酶切过后，点1-2ul电泳看看，其他的直接用PCR产物试剂盒回收，这比胶回收得率要高得多。

酶切体系质粒加了20ul，ncoi加0.5，xhoi加了0.5，bufferR（2*tango是8ul）加了4ul，水是15ul。
赞一下 回复此楼
3楼2013-11-28 09:46:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ningning915

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lpzl at 2013-11-28 09:36:14
酶切体系是啥样的？
酶切是不是太久了？我用这两个酶最多也就切3h，还有酶切过后，点1-2ul电泳看看，其他的直接用PCR产物试剂盒回收，这比胶回收得率要高得多。

但是2个酶切位点之间有191bp的碱基，这么做自连会不会太多？？
赞一下 回复此楼
4楼2013-11-28 09:48:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zh10246

铁杆木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-28 10:47:09
gyesang: 回帖置顶 2013-11-28 10:47:31
ningning915: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-11-28 11:03:50
1，做阳性对照；
2，检查你的退火后的双链是有OVERHANG的，就如酶切后的一样；
3，电泳检查你确实回收到了酶切后的载体，
4，如果再做酶切可以时间短一点，一个小时就够了，这样做克隆也快。
赞一下 回复此楼
5楼2013-11-28 10:07:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ningning915

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by zh10246 at 2013-11-28 10:07:04
1，做阳性对照；
2，检查你的退火后的双链是有OVERHANG的，就如酶切后的一样；
3，电泳检查你确实回收到了酶切后的载体，
4，如果再做酶切可以时间短一点，一个小时就够了，这样做克隆也快。

怎么检查我的退火后的双链是有OVERHANG，酶切后载体胶回收能够检测到，但是相对于目的条带比较暗，酶切一个小时会不会切不开，影响连接。阳性对照是指的转质粒么？这个我做过，长的
赞一下 回复此楼
6楼2013-11-28 10:31:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zh10246

铁杆木虫 (文坛精英)
引用回帖:
6楼: Originally posted by ningning915 at 2013-11-28 10:31:08
怎么检查我的退火后的双链是有OVERHANG，酶切后载体胶回收能够检测到，但是相对于目的条带比较暗，酶切一个小时会不会切不开，影响连接。阳性对照是指的转质粒么？这个我做过，长的...

怎么检查我的退火后的双链是有OVERHANG，就是设计两条引物的时候，退火后，末端是和酶切后突出来的一样，刚好和酶切后的载体连上，
你可以做个试验，看看一个小时是否能切开，
赞一下 回复此楼
7楼2013-11-28 10:38:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zh10246

铁杆木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

CATGGXXXXXXXC
                        CXXXXXXXGAGCT
你的退火后的序列
赞一下 回复此楼
8楼2013-11-28 10:45:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ningning915

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by zh10246 at 2013-11-28 10:45:52
CATGGXXXXXXXC
                        CXXXXXXXGAGCT
你的退火后的序列

退火后是这样的，没有错
赞一下 回复此楼
9楼2013-11-28 10:51:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zh10246

铁杆木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by ningning915 at 2013-11-28 10:51:43
退火后是这样的，没有错...

看看连接酶的BUFFER有没有问题，用新的看看
赞一下 回复此楼
10楼2013-11-28 10:54:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 ningning915 的主题更新
231/3返回列表123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 085600调剂 +9 东照照照 2026-04-04 9/450 2026-04-05 13:44 by ujn_zhuj
[考研] 282求调剂 +6 aaa车辆 2026-04-02 10/500 2026-04-05 12:10 by arrow8852
[考研] 一志愿 南京航空航天大学 ，080500材料科学与工程学硕 +8 @taotao 2026-03-30 8/400 2026-04-05 11:15 by 风雨无晴
[考研] 材料求调剂 +10 呢呢妮妮 2026-04-01 10/500 2026-04-04 23:12 by 无际的草原
[考研] 286求调剂 +3 草木不言 2026-04-04 3/150 2026-04-04 22:40 by lbsjt
[考研] 材料与化工306分找调剂 +23 沧海轻舟e 2026-04-02 27/1350 2026-04-04 21:52 by laoshidan
[考研] 266求调剂 +8 学员97LZgn 2026-04-03 8/400 2026-04-04 09:02 by 20021109
[考研] 求调剂，一志愿南京航空航天大学 ，080500材料科学与工程学硕 +10 @taotao 2026-04-03 10/500 2026-04-04 09:01 by T可可西里T
[考研] 281求调剂 +10 aaawhy 2026-04-03 10/500 2026-04-03 21:42 by lbsjt
[考研] 343求调剂085601 +6 要努力学习x 2026-03-29 7/350 2026-04-03 19:49 by 百灵童888
[考研] 22408 266求调剂 +3 masss11222 2026-04-02 3/150 2026-04-02 18:11 by 笔落锦州
[考研] 362求调剂 +14 西南交材料专硕3 2026-03-31 14/700 2026-04-02 17:50 by yunlongyang
[考研] 282求调剂 +13 呼吸都是减肥 2026-04-01 13/650 2026-04-02 14:10 by baoball
[考研] 322求调剂 +5 熹僖XX 2026-03-31 6/300 2026-04-02 10:08 by 求调剂zz
[考研] 372求调剂 +3 jj涌77 2026-04-02 3/150 2026-04-02 09:57 by olim
[考研] 307分求调剂 +14 (o~o) 2026-03-31 15/750 2026-04-01 20:43 by longlotian
[考研] 0703一志愿南师大334求调剂 +4 seven7yu 2026-03-30 4/200 2026-04-01 16:10 by oooqiao
[考研] 求调剂 +4 DADA怪 2026-03-31 4/200 2026-04-01 14:30 by ZXlzxl0425
[考研] 274求调剂 +6 xiao爱同学 2026-03-30 6/300 2026-03-31 10:04 by cal0306
[考研] 求调剂 +10 家佳佳佳佳佳 2026-03-29 10/500 2026-03-30 18:34 by 544594351
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭