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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » XhoI和NcoI双酶切之后连接转化不长克隆
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ningning915

新虫 (小有名气)
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7楼: Originally posted by zh10246 at 2013-11-28 10:38:25
怎么检查我的退火后的双链是有OVERHANG，就是设计两条引物的时候，退火后，末端是和酶切后突出来的一样，刚好和酶切后的载体连上，
你可以做个试验，看看一个小时是否能切开，...

恩，那跟载体回收后浓度低有关么？？目的片段直接退火的，不需要酶切跟回收，量特别大，会影响连接么？？
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11楼2013-11-28 10:54:56
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ningning915

新虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by zh10246 at 2013-11-28 10:54:45
看看连接酶的BUFFER有没有问题，用新的看看...

最近实验室做克隆的挺多，大家的都出来了。。酶是一样的，buffer也是一样的。这个应该没有问题
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12楼2013-11-28 10:56:56
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zh10246

铁杆木虫 (文坛精英)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-29 13:11:47
引用回帖:
11楼: Originally posted by ningning915 at 2013-11-28 10:54:56
恩，那跟载体回收后浓度低有关么？？目的片段直接退火的，不需要酶切跟回收，量特别大，会影响连接么？？...

你可以做几个比例看看，一般INSERT都是过量的，你可以计算摩尔比3：1,1:1 或其他比例，
另外如果想省点，比如一般10UL体系，也可以做5UL的，这样就减半了，效果还可以。当然是否需要自己掌握吧。对于你来说，节省不是目的，尽快做出来才重要
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13楼2013-11-28 10:59:52
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ningning915

新虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by zh10246 at 2013-11-28 10:59:52
你可以做几个比例看看，一般INSERT都是过量的，你可以计算摩尔比3：1,1:1 或其他比例，
另外如果想省点，比如一般10UL体系，也可以做5UL的，这样就减半了，效果还可以。当然是否需要自己掌握吧。对于你来说，节省 ...

是的，非常感谢，我先试试的。
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14楼2013-11-28 11:02:22
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lpzl

木虫 (正式写手)
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4楼: Originally posted by ningning915 at 2013-11-28 09:48:37
但是2个酶切位点之间有191bp的碱基，这么做自连会不会太多？？...


做连接的时候可以把载体和目的片段加后，放65度5min，然后等其自然冷却后，再加酶和buffer。
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Start_everyday_with_a_new_hope,_leave_bad_memories...
15楼2013-11-28 19:50:43
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sanmiao

木虫 (正式写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-29 13:11:57
这个你应该检查你的目的片段的PCR产物，但是目的片段在设计PCR引物的时候，加上的酶切位点，头上有没有保护碱基，或者保护碱基合适不合适，这将直接导致你的实验结果！
你可以先连接到T载体上，再从T载体上切下来，在连，就OK了！！！
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16楼2013-11-29 12:05:46
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ningning915

新虫 (小有名气)
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15楼: Originally posted by lpzl at 2013-11-28 19:50:43

做连接的时候可以把载体和目的片段加后，放65度5min，然后等其自然冷却后，再加酶和buffer。
...

下次我试试这么连接。
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17楼2013-11-29 15:48:46
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ningning915

新虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by sanmiao at 2013-11-29 12:05:46
这个你应该检查你的目的片段的PCR产物，但是目的片段在设计PCR引物的时候，加上的酶切位点，头上有没有保护碱基，或者保护碱基合适不合适，这将直接导致你的实验结果！
你可以先连接到T载体上，再从T载体上切下来， ...

我不做pcr的，就直接用2条引物退火，得到目的片段，所以也没有设计保护碱基，目的片段不需要酶切。
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18楼2013-11-29 15:50:56
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ningning915

新虫 (小有名气)
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2楼: Originally posted by lpzl at 2013-11-28 09:36:14
酶切体系是啥样的？
酶切是不是太久了？我用这两个酶最多也就切3h，还有酶切过后，点1-2ul电泳看看，其他的直接用PCR产物试剂盒回收，这比胶回收得率要高得多。

你也是用的这两个酶么，我开始做的时候，自连长了很多，就怀疑没切开，然后切的时间就长。
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19楼2013-11-29 15:52:59
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lpzl

木虫 (正式写手)
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19楼: Originally posted by ningning915 at 2013-11-29 15:52:59
你也是用的这两个酶么，我开始做的时候，自连长了很多，就怀疑没切开，然后切的时间就长。...

是的，我也是用这两个酶
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20楼2013-12-01 10:15:43
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