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ningning915

新虫 (小有名气)


引用回帖:
7楼: Originally posted by zh10246 at 2013-11-28 10:38:25
怎么检查我的退火后的双链是有OVERHANG,就是设计两条引物的时候,退火后,末端是和酶切后突出来的一样,刚好和酶切后的载体连上,
你可以做个试验,看看一个小时是否能切开,...

恩,那跟载体回收后浓度低有关么??目的片段直接退火的,不需要酶切跟回收,量特别大,会影响连接么??
11楼2013-11-28 10:54:56
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ningning915

新虫 (小有名气)


引用回帖:
10楼: Originally posted by zh10246 at 2013-11-28 10:54:45
看看连接酶的BUFFER有没有问题,用新的看看...

最近实验室做克隆的挺多,大家的都出来了。。酶是一样的,buffer也是一样的。这个应该没有问题
12楼2013-11-28 10:56:56
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zh10246

铁杆木虫 (文坛精英)

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-11-29 13:11:47
引用回帖:
11楼: Originally posted by ningning915 at 2013-11-28 10:54:56
恩,那跟载体回收后浓度低有关么??目的片段直接退火的,不需要酶切跟回收,量特别大,会影响连接么??...

你可以做几个比例看看,一般INSERT都是过量的,你可以计算摩尔比3:1,1:1 或其他比例,
另外如果想省点,比如一般10UL体系,也可以做5UL的,这样就减半了,效果还可以。当然是否需要自己掌握吧。对于你来说,节省不是目的,尽快做出来才重要
13楼2013-11-28 10:59:52
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ningning915

新虫 (小有名气)


引用回帖:
13楼: Originally posted by zh10246 at 2013-11-28 10:59:52
你可以做几个比例看看,一般INSERT都是过量的,你可以计算摩尔比3:1,1:1 或其他比例,
另外如果想省点,比如一般10UL体系,也可以做5UL的,这样就减半了,效果还可以。当然是否需要自己掌握吧。对于你来说,节省 ...

是的,非常感谢,我先试试的。
14楼2013-11-28 11:02:22
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lpzl

木虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by ningning915 at 2013-11-28 09:48:37
但是2个酶切位点之间有191bp的碱基,这么做自连会不会太多??...


做连接的时候可以把载体和目的片段加后,放65度5min,然后等其自然冷却后,再加酶和buffer。
Start_everyday_with_a_new_hope,_leave_bad_memories...
15楼2013-11-28 19:50:43
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sanmiao

木虫 (正式写手)

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-11-29 13:11:57
这个你应该检查你的目的片段的PCR产物,但是目的片段在设计PCR引物的时候,加上的酶切位点,头上有没有保护碱基,或者保护碱基合适不合适,这将直接导致你的实验结果!
你可以先连接到T载体上,再从T载体上切下来,在连,就OK了!!!
16楼2013-11-29 12:05:46
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ningning915

新虫 (小有名气)


引用回帖:
15楼: Originally posted by lpzl at 2013-11-28 19:50:43

做连接的时候可以把载体和目的片段加后,放65度5min,然后等其自然冷却后,再加酶和buffer。
...

下次我试试这么连接。
17楼2013-11-29 15:48:46
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ningning915

新虫 (小有名气)


引用回帖:
16楼: Originally posted by sanmiao at 2013-11-29 12:05:46
这个你应该检查你的目的片段的PCR产物,但是目的片段在设计PCR引物的时候,加上的酶切位点,头上有没有保护碱基,或者保护碱基合适不合适,这将直接导致你的实验结果!
你可以先连接到T载体上,再从T载体上切下来, ...

我不做pcr的,就直接用2条引物退火,得到目的片段,所以也没有设计保护碱基,目的片段不需要酶切。
18楼2013-11-29 15:50:56
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ningning915

新虫 (小有名气)


引用回帖:
2楼: Originally posted by lpzl at 2013-11-28 09:36:14
酶切体系是啥样的?
酶切是不是太久了?我用这两个酶最多也就切3h,还有酶切过后,点1-2ul电泳看看,其他的直接用PCR产物试剂盒回收,这比胶回收得率要高得多。

你也是用的这两个酶么,我开始做的时候,自连长了很多,就怀疑没切开,然后切的时间就长。
19楼2013-11-29 15:52:59
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lpzl

木虫 (正式写手)

引用回帖:
19楼: Originally posted by ningning915 at 2013-11-29 15:52:59
你也是用的这两个酶么,我开始做的时候,自连长了很多,就怀疑没切开,然后切的时间就长。...

是的,我也是用这两个酶
Start_everyday_with_a_new_hope,_leave_bad_memories...
20楼2013-12-01 10:15:43
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