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sicau_yang

金虫 (小有名气)

[交流] 关于pET32a空载分子量的问题 已有1人参与

文章审稿人提出一个问题,是关于pET32a融合表达蛋白分子量的问题,question如下“Authors expressed their recombinant protein using the pET32a from Novagen. According to the Novagen website: "The pET-32 series is designed for cloning and high-level expression of peptide sequences fused with the 109 aa Trx*Tag? thioredoxin protein". Then, the rTpFABP is not fused with an histidine Tag but with the thioredoxin. Then, considering that the rTpFABP and the thioredoxin protein have a sequence of 133aa and 109aa, respectively, the theoretical molecular weight of the fusion protein should be around 25kDa. How authors explain the difference with the 36.1 kDa indicated in the "rTpFABP expression and Western blotting" section page 11? Did authors fused something else than the thioredoxin and the His tag (negligible in molecular weight)?”
        一般来说pET32a空载的话分子量大约为21kDa,我的蛋白分子量大约为15kda,不知道review怎么算的,融合分子量只有25kd,大家怎么看呢?谢谢。
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
你用的什么酶切位点?自己的基因后面有没有带终止密码子?
现在的情况看来审稿人的计算基本没问题。
2楼2013-11-19 12:42:24
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sicau_yang

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by lxj341401 at 2013-11-19 12:42:24
你用的什么酶切位点?自己的基因后面有没有带终止密码子?
现在的情况看来审稿人的计算基本没问题。

用的是BamH1 and Xhol,但是表达时还有其他的标签和酶切位点,以及其他会表达部分,我统计了一下总共是582 bp,再加上我自己的蛋白是399 bp,分子量算下来接近36 kDa。
3楼2013-11-19 17:12:43
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by sicau_yang at 2013-11-19 17:12:43
用的是BamH1 and Xhol,但是表达时还有其他的标签和酶切位点,以及其他会表达部分,我统计了一下总共是582 bp,再加上我自己的蛋白是399 bp,分子量算下来接近36 kDa。...

如果用的载体确认是用的是pET32a,酶切位点是BamH1/Xhol,那么你目的基因前面的读码框483bp,不是你说的582bp。
就算是你说的大小,审稿人提这个问题,就说明你论文中没有表述清楚,让审稿人产生疑问,重新表述下该部分,然后回答审稿人的疑问就是了。
4楼2013-11-19 17:43:11
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