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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 存档旧帖 » 大肠杆菌基因组提取时A260/280比值小于1.7，怎么可以使比值升高？
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梧桐柒夕

主管区长 (文坛精英)

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[求助] 大肠杆菌基因组提取时A260/280比值小于1.7，怎么可以使比值升高？

提取方法中采用蛋白酶K温育，10~60min都已尝试，且酶量为40微的10mg/ml，实验中采用磁球进行DNA吸附，洗脱，电泳。电泳图很干净，确定是基因组。但用K5500测得比值偏低，同时A260/230比值低于1.求诸位大神指导。
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1楼 2013-11-09 17:40:51
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 。 2013-11-10 13:58:22
梧桐柒夕: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-11-10 18:25:46
A260/280低说明有蛋白杂质污染。蛋白酶K作用不是除蛋白，是去掉核酸酶活性的。实在不行的话，用酚氯仿抽提后再吸附。A260/230低是因为有有机试剂污染，可能是洗涤时的酒精残余。可以让酒精挥发一会后再洗脱。
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2楼2013-11-10 04:54:08
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梧桐柒夕

主管区长 (文坛精英)

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引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-11-10 04:54:08
A260/280低说明有蛋白杂质污染。蛋白酶K作用不是除蛋白，是去掉核酸酶活性的。实在不行的话，用酚氯仿抽提后再吸附。A260/230低是因为有有机试剂污染，可能是洗涤时的酒精残余。可以让酒精挥发一会后再洗脱。

现在情况是这样的，我在做一种提基因组的方法研究，目的就是不用酚氯仿，如果调解pH或是温度什么的可以去蛋白么？还有，关于70%乙醇的，挥发半个小时也试过，在测K5500也是放置很久后才测得，这样的时间乙醇依然挥发不尽？
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3楼2013-11-10 12:39:39
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 梧桐柒夕 at 2013-11-10 12:39:39
现在情况是这样的，我在做一种提基因组的方法研究，目的就是不用酚氯仿，如果调解pH或是温度什么的可以去蛋白么？还有，关于70%乙醇的，挥发半个小时也试过，在测K5500也是放置很久后才测得，这样的时间乙醇依然挥 ...

用吸附的方法一般蛋白不会很多，但是有些蛋白与核酸形成复合物，用CTAB法对解离核酸蛋白复合物有一定帮助，用温度、pH之类的方法除蛋白没有听说过。酚氯仿主要可以一定程度上变性蛋白，并从核酸上解离下来，是常用的除去核酸样品中蛋白的方法。
至于你的乙醇挥发不干净的问题，一般不会，通常离心后再放置几分钟就可以了。
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4楼2013-11-10 13:00:59
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梧桐柒夕

主管区长 (文坛精英)

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引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-11-10 13:00:59
用吸附的方法一般蛋白不会很多，但是有些蛋白与核酸形成复合物，用CTAB法对解离核酸蛋白复合物有一定帮助，用温度、pH之类的方法除蛋白没有听说过。酚氯仿主要可以一定程度上变性蛋白，并从核酸上解离下来，是常用 ...

A260/230值偏低，有时会是小分子如氨基酸、多肽类的影响，如果不是乙醇的影响是此类的么？
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5楼2013-11-10 13:08:59
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