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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 克隆转化，转化子就是不含目的基因。
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林默泪

新虫 (初入文坛)

[求助] 克隆转化，转化子就是不含目的基因。

我的目的基因是750bp，质粒载体是PET-24a。
我从我师兄的菌提取质粒，然后用KOD酶PCR目的基因。
然后两步酶切质粒和目的基因。NdeI酶切，胶回收，再BamHI酶切，再回收。酶切时间是3个小时以上。
提质粒、PCR、回收后都有电泳检测，条带位置正确。
然后用东洋纺的高效链接液链接目的基因和质粒的酶切片段。连接时间大概时2个小时以上。
转化到感受态细胞JM109，热击法。
然后培养在含Kan+的平板上。
第一次没有长，第二次4个平板，只有一个平板上长了3个，第三次，4个平板上都有，每个大约3—5个。
PCR检测，都没有P出目的片段。

想请教下各位大神，大概会是什么问题，那些地方需要改进。
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1楼 2013-11-04 16:16:11
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林默泪

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
11楼: Originally posted by liaohongbin at 2013-11-07 14:26:54
可以用两个酶，分别对载体进行分布单切，t4自连转一下。看看是不是其中一个酶不好，或者直接换新的酶。
连接效率不太高，增加目的片段浓度，延长连接时间，推荐4℃过夜连接。
转化时顺便测一下转化效率，低于10^6 ...

谢谢，我试试看。
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12楼2013-11-08 08:47:15
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励交流！ 2013-11-05 00:31:43
提提质粒酶切看看


最好用快速内切酶，不用依次酶切，浪费不少时间
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2楼2013-11-04 23:30:40
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machao8405

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
感受态的问题？不加抗生素，不热激直接图一个板试试

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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3楼2013-11-04 23:33:51
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林默泪

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by machao8405 at 2013-11-04 23:33:51
感受态的问题？不加抗生素，不热激直接图一个板试试

这个对照做过，没有问题。
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4楼2013-11-05 13:34:12
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