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wwsswww

金虫 (初入文坛)

[求助] 血小板黏附实验 拍电镜未得到想要的结果 一些问题

最近在做血小板黏附实验，拍了几次SEM感觉制样失败，请大家帮忙看看是哪里出了问题，热烈欢迎多多讨论。
材料是薄膜形态。
------------------------------------------------------
富血小板血浆（PRP)制备：采用的是兔血，耳缘取血后，以 9:1 与 109 mol/L 柠檬酸三钠溶液混合，1200rpm 离心15min，取上层清液。
黏附过程：37℃，将材料浸泡1h；PBS轻轻洗涤；用2.5%戊二醛-PBS溶液在4℃下固定24h;乙醇-水溶液(30,50,70,80,90,95,100%)梯度脱水,每个梯度30min;喷金测SEM.
-------------------------------------------------------
拍得电镜图如下

血小板黏附实验 拍电镜未得到想要的结果 一些问题
血小板黏附实验 拍电镜未得到想要的结果 一些问题-1
文献中的如下

血小板黏附实验 拍电镜未得到想要的结果 一些问题-2

和文献对比发现完全不像，拍出来椭圆状的不像血小板有伪足伸出。
-------------------------------------------------------
疑问：1.PRP的制备中是不是有问题，而导致没有收集到富含血小板的血浆;
          2.有些文献中梯度脱水溶液是用乙醇和PBS配制的，但是乙醇含量50%以后就会出现浑浊，应该是盐在乙醇中的溶解度下降导致的，所以不清楚这个乙醇-PBS到底是怎么配制的；
          3.电镜图上有些点，没有具体形貌，会不会是操作过程中混入的脏东西;
          4.最后的干燥，如果不用冻干机，置于干燥器中自然晾干是否可行呢.
   
各位前辈大牛，求解答。。。

[ Last edited by wwsswww on 2013-10-11 at 10:23 ]
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1楼 2013-10-11 10:20:18
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lynne619

木虫 (著名写手)
感觉在里面看到了红细胞~~
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2楼2013-10-11 10:25:44
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lynne619

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wwsswww: 金币+5 2013-10-18 08:52:52
另外你脱水之后，没有脱醇哦~乙酸异戊脂 脱醇
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3楼2013-10-11 10:28:18
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wwsswww

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lynne619 at 2013-10-11 10:25:44
感觉在里面看到了红细胞~~

我也觉得椭圆的东西像是红细胞- -！
应该是是PRP没有制备好导致的？
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4楼2013-10-11 10:28:21
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金虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lynne619 at 2013-10-11 10:28:18
另外你脱水之后，没有脱醇哦~乙酸异戊脂 脱醇

嗯，是的，没有再用乙酸异戊酯。
我是这样想的，即使没有脱醇，那也至少应该有一些血小板出现（就算形貌不好看），可现在看问题貌似不出在这一步？
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5楼2013-10-11 10:31:44
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lynne619

木虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by wwsswww at 2013-10-11 10:28:21
我也觉得椭圆的东西像是红细胞- -！
应该是是PRP没有制备好导致的？...

我是上学的时候做过这个实验，具体记不清了。这个帖子http://muchong.com/html/200908/1487363.html上面说富含血小板血浆上层液（PRP）再以3000r／min离心10min，制备得到血小板血浆（PPP）。你可以点击链接看看~
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6楼2013-10-11 10:39:19
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lynne619

木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by wwsswww at 2013-10-11 10:31:44
嗯，是的，没有再用乙酸异戊酯。
我是这样想的，即使没有脱醇，那也至少应该有一些血小板出现（就算形貌不好看），可现在看问题貌似不出在这一步？...

是滴，问题不在这一步，不过既然传统过程是这样滴，不要偷工减料好不好呀~~汗~
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7楼2013-10-11 10:40:30
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wwsswww

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by lynne619 at 2013-10-11 10:40:30
是滴，问题不在这一步，不过既然传统过程是这样滴，不要偷工减料好不好呀~~汗~...

主要是好多相关文献中也不提到后面的脱醇，所以~~

看了给的链接，请问,你当时离心是要离两次再混合吗？论坛里相关帖子都看了一遍，基本是离心一次取上层的。
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8楼2013-10-11 10:50:18
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lynne619

木虫 (著名写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by wwsswww at 2013-10-11 10:50:18
主要是好多相关文献中也不提到后面的脱醇，所以~~

看了给的链接，请问,你当时离心是要离两次再混合吗？论坛里相关帖子都看了一遍，基本是离心一次取上层的。...

...具体确实记不清了~~这已经是五年前滴事情鸟~
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9楼2013-10-11 10:53:11
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金虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by lynne619 at 2013-10-11 10:53:11
...具体确实记不清了~~这已经是五年前滴事情鸟~...

还是非常感谢
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10楼2013-10-11 10:55:00
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