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ferments

新虫 (初入文坛)

[交流] HIS-Bcl2 已有1人参与

请问各位大神有没有纯化HIS-Bcl2蛋白的？要用多少mM的浓度的咪唑才能把Bcl2蛋白洗下来啊 ？？？最近做binding分析，头大啊 急急急急！！！ 谢谢啦
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1楼 2013-09-26 20:09:48
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shyh1983

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-28 20:39:44
对于带有6His tag重组蛋白的纯化，首先可以用含有20mM、40mM、60mM咪唑的缓冲液漂洗以去除杂蛋白（此3个梯度并非固定，可适当调整），最后的洗脱可用250mM-500mM咪唑的Elution Buffer洗脱，据我个人经验，一般用250或300mM咪唑就能几乎完全洗脱目的蛋白。祝顺！
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2楼2013-09-28 10:54:56
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ferments

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by shyh1983 at 2013-09-28 10:54:56
对于带有6His tag重组蛋白的纯化，首先可以用含有20mM、40mM、60mM咪唑的缓冲液漂洗以去除杂蛋白（此3个梯度并非固定，可适当调整），最后的洗脱可用250mM-500mM咪唑的Elution Buffer洗脱，据我个人经验，一般用250 ...

谢谢你的回复，我的实验目的是做个PULL-DOWN  就是要把his非特异性结合的蛋白去除

具体如下：A蛋白和B蛋白，其中B蛋白带有HIS tag ，A蛋白没有，B 蛋白有可能和A蛋白发生相互作用，这样的话用NI-NTA beads结合的话，B蛋白就会结合到beads上去，A蛋白也就被B蛋白拉住了。有缓冲液西区未结合的A,B蛋白就可以跑胶验证了。  一个问题是我们发现不带his的A蛋白也能和NI-NTA结合，所以要用咪唑洗去这种非特异性结合，可是我们目前还没有找到一个合适的浓度可以洗去这种非特异性结合，而又不能把特异性结合洗下来。 所以请教大虾你多多指教。
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3楼2013-09-29 08:58:57
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