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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 有关于DAPI染色的问题
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小木棉要努力

木虫 (正式写手)

[求助] 有关于DAPI染色的问题

本人最近在做海水中细菌计数的实验，用到的染料为DAPI（买来是10mg一小瓶粉末的那种），在操作中碰到几个问题，想让有经验的大虾帮我看看操作是否正确~
我的操作过程是：用10mL的无菌水将10mg的DAPI粉末稀释成1mg/mL的工作液，置于-20℃下冻存，实验时提前取出使其解冻，染色时抽滤水体到差不多剩3mL的时候加入20μL染液，黑暗下染5~10min后全部抽干净水，再拿膜去观察计数。问题有：
1、加入20μL DAPI染液，这个量合适吗？
2、每次实验前都要拿DAPI出来解冻，也就是存在一个反复冻融的过程，这样会不会不太好呢？
3、一般在膜与载玻片之间要滴一滴镜油，那么在膜与盖玻片之间还需滴一滴镜油吗？
我有滴过，但在观察计数的时候常发现细菌会随着油流动而不好计数，是否这滴油可以不加了？
问题比较多，描述比较唠叨，谢谢大家的帮助！
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1楼 2013-09-25 04:04:49
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a46750

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
zhang8826857: 金币+1, 鼓励应助 2013-09-25 09:40:32
建议
1、 300 nM  300 μL，0.5-10μg/ml
2、DAPI相对较稳定，长时间不用少配点，较常用放在4度内就可以了
3、不懂
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.........
2楼2013-09-25 08:41:24
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yawei1983

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木棉要努力: 金币+20, ★★★很有帮助 2013-10-10 11:08:06
1. DAPI的使用浓度0.4ug/mL足矣。
2. 建议可以配一个高浓度的储存液和10*的工作液（4ug/mL），每次只需要把一小瓶工作液拿出融化即可。这样就可防止每次都把所有的液体都拿出冻融一次。
3. 膜与载玻片之间需要加一点油，一点点就好，然后可以用手将油抹开，这样再放膜就不容易到处跑，是为了好固定膜的。在盖玻片滴2-3小滴油，盖上后用手压一下，感觉同样是为了固定膜与盖玻片的位置。
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3楼2013-10-10 04:51:21
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小木棉要努力

木虫 (正式写手)
内容已删除
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4楼2013-10-10 11:09:32
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小数点123

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 小木棉要努力 at 2013-10-10 11:09:32
3、我在盖玻片与黑膜中滴加过油了，发现在荧光显微镜下细菌会随着油移动，后来我又试了片没滴加镜油的，发现效果好像还要更好些呢...

我想问一下，dapi买的价格大概是多少？
我最近在做土壤中微生物量的测定，希望有机会可以和你交流一下
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5楼2013-10-10 11:52:52
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小木棉要努力

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 小数点123 at 2013-10-10 11:52:52
我想问一下，dapi买的价格大概是多少？
我最近在做土壤中微生物量的测定，希望有机会可以和你交流一下...

DAPI 10毫克卖800元的样子，有时他们搞活动会便宜点。
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6楼2013-10-10 16:17:49
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小数点123

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 小木棉要努力 at 2013-10-10 16:17:49
DAPI 10毫克卖800元的样子，有时他们搞活动会便宜点。...

恩，好的。
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7楼2013-10-11 07:28:00
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llun1990

金虫 (正式写手)
楼主能不能给个 DAPI 计数的文献，谢谢了
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惟草木之零落兮，恐美人之迟暮。
8楼2013-10-13 21:20:23
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随缘yan

新虫 (初入文坛)
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9楼2013-11-14 22:41:46
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a46750

铁杆木虫 (著名写手)
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.........
10楼2013-11-15 08:28:04
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