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小木棉要努力

木虫 (正式写手)

[求助] 有关于DAPI染色的问题

本人最近在做海水中细菌计数的实验,用到的染料为DAPI(买来是10mg一小瓶粉末的那种),在操作中碰到几个问题,想让有经验的大虾帮我看看操作是否正确~
我的操作过程是:用10mL的无菌水将10mg的DAPI粉末稀释成1mg/mL的工作液,置于-20℃下冻存,实验时提前取出使其解冻,染色时抽滤水体到差不多剩3mL的时候加入20μL染液,黑暗下染5~10min后全部抽干净水,再拿膜去观察计数。问题有:
1、加入20μL DAPI染液,这个量合适吗?
2、每次实验前都要拿DAPI出来解冻,也就是存在一个反复冻融的过程,这样会不会不太好呢?
3、一般在膜与载玻片之间要滴一滴镜油,那么在膜与盖玻片之间还需滴一滴镜油吗?
我有滴过,但在观察计数的时候常发现细菌会随着油流动而不好计数,是否这滴油可以不加了?
问题比较多,描述比较唠叨,谢谢大家的帮助!
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小数点123

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 小木棉要努力 at 2013-10-10 16:17:49
DAPI 10毫克卖800元的样子,有时他们搞活动会便宜点。...

恩,好的。
7楼2013-10-11 07:28:00
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a46750

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
zhang8826857: 金币+1, 鼓励应助 2013-09-25 09:40:32
建议
1、 300 nM  300 μL,0.5-10μg/ml
2、DAPI相对较稳定,长时间不用少配点,较常用放在4度内就可以了
3、不懂
.........
2楼2013-09-25 08:41:24
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yawei1983

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木棉要努力: 金币+20, ★★★很有帮助 2013-10-10 11:08:06
1. DAPI的使用浓度0.4ug/mL足矣。
2. 建议可以配一个高浓度的储存液和10*的工作液(4ug/mL),每次只需要把一小瓶工作液拿出融化即可。这样就可防止每次都把所有的液体都拿出冻融一次。
3. 膜与载玻片之间需要加一点油,一点点就好,然后可以用手将油抹开,这样再放膜就不容易到处跑,是为了好固定膜的。在盖玻片滴2-3小滴油,盖上后用手压一下,感觉同样是为了固定膜与盖玻片的位置。
3楼2013-10-10 04:51:21
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小数点123

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 小木棉要努力 at 2013-10-10 11:09:32
3、我在盖玻片与黑膜中滴加过油了,发现在荧光显微镜下细菌会随着油移动,后来我又试了片没滴加镜油的,发现效果好像还要更好些呢...

我想问一下,dapi买的价格大概是多少?
我最近在做土壤中微生物量的测定,希望有机会可以和你交流一下
5楼2013-10-10 11:52:52
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