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实验准备中金虫 (小有名气)
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[求助]
求助：极性大的大分子物质的分离
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| 分离出来了一个大分子物质，极性很大，点了硅胶板，点停留在原点基本不动，凝胶柱也试过了，分子量太大基本不停留，结果杂质依然很多。我该用什么办法分离呢？求助 |
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 蛋白质生物学实验经验 |
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凌波丽
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+5, 鼓励交流 2013-09-24 11:53:26
silicare: MolEPI+1 2014-05-23 08:03:43
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kx444555: 金币+5, 鼓励交流 2013-09-24 11:53:26
silicare: MolEPI+1 2014-05-23 08:03:43
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既然生物大分子的极性大，那么可以考虑用强离子交换交换层析柱试试看。 可在摸索方法的过程中用较宽的pH值范围。对于一个已知等电点的蛋白质，可根据其等电点来选择离子交换柱上的离子交换剂（离子交换剂基团不是洗脱缓冲液，是交换柱柱上的带电荷的基团，比如:羧甲基、季氨基、二乙基氨乙基等）。如果选用的离子交换柱上的离子交换剂是阴离子交换剂，使用缓冲溶液的pH值应高于该蛋白质的等电点，因为此时的蛋白质在缓冲溶液中携带净负电荷，可与离子交换柱上的阴离子交换剂结合。如果选择如果选用的离子交换柱上的离子交换剂是阳离子交换剂，使用缓冲溶液的pH值应高于该蛋白质的等电点，因为此时的蛋白质在缓冲溶液中携带净正电荷，可与离子交换柱上的阳离子交换剂结合。 对于未知的等电点的蛋白质，可以用DNAstar中的Protein,打开和新建一个序列文件。选择Analysis ---->Tritration Curve,会出来滴定曲线，横坐标为电荷数，纵坐标为pH值，在滴定曲线上找到电荷数为零的pH值即为等电点。也可以到蛋白质数据库中搜索出该蛋白质的的等电点。 未知的等电点的蛋白质，如果不是先用用软件预测其等电点，也不到到蛋白质数据库中搜索出该蛋白质的的等电点，或者说就是个未知蛋白质，而且也不愿意做等电聚焦。在这种情况下，对于未知的等电点的蛋白质，也可以直接上离子交换柱，但是操作有一定困难。此时选择离子交换柱上的离子交换剂（离子交换剂基团不是洗脱缓冲液，是交换柱柱上的带电荷的基团，比如:羧甲基、季氨基、二乙基氨乙基等）比较费事。在实际操作中常选择这样的方法：先选择一个阴离子交换剂（离子交换剂基团不是洗脱缓冲液，是交换柱柱上的带电荷的基团，比如:羧甲基、季氨基、二乙基氨乙基等），再寻则一个中性的pH缓冲溶液（pH大约为7)，将蛋白质pH为7的环境下透析去掉小分子杂质，然后过阴离子交换柱，根据过柱后的结果确定下一个使用的缓冲溶液的pH值。如果目的蛋白质在穿过液中，也就是没有结合到交换柱上直接流出了，那木说明目的蛋白质在该pH下带有正电荷，可将缓冲溶液的pH升高1，然后在将蛋白质pH为8的环境下透析去掉小分子杂质，然后再过阴离子交换柱，根据过柱后的结果确定下一个使用的缓冲溶液的pH值。以此类推，直到目的蛋白质能够结合到阴离子交换柱为止。也可以使用阳离子交换柱做类似的选择。 |
2楼2013-09-24 11:27:28
凌波丽
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4楼2013-09-24 12:06:32
zhenwuhuang
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