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hqc87铁虫 (小有名气)
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如何确定一个转录因子结合的特定DNA序列
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| 最近用酵母单杂筛出一个能结合于我的基因启动子的转录因子（该转录因子已知信息很少），并用Gap repair 验证该转录因子确实能结合于我的启动子上，我用于做酵母单杂的启动子长度是749bp，我的问题是如何找出这个转录因子结合在这749bp的哪几个特定碱基上？我也搜索了DNA footprinting 方法，感觉都是在验证蛋白于DNA的结合与否，如何测定结合部位的序列并没有太详细的参考资料。求做过此方面的同学、老师献谋献计，给出整体方案后，最好也提供详细的步骤，谢谢。 |
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 核酸生物学实验经验 |
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hqc87: 金币+5, 谢谢回复 2013-09-20 05:43:05
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http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6271476&authorid=1766465 请参考该贴的回答的第十楼，我写的回帖内容。愿意讨论我们继续讨论。 |
2楼2013-09-19 20:26:05
hqc87
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看了您的回帖，感觉你确实熟悉很多技术，我很多都没有听说过，而且实验室条件也不允许。目前我的情况是转录因子是从商业转录因子库里筛出的，序列知道，但是BLAST后并没有太多信息都是uncharacterized protein，所以其功能未知，通过单杂确定其能结合到我的启动子上但是启动子太长，如何找到其结合的某几个特定碱基，貌似可以用DNA footprinting。我的问题是1.DNA 足迹法一般用较短的DNA序列，首先我的启动子750bp是不是需要用限制酶切成几个小片段再分别做？2.DNAase I处理跑胶后，和蛋白结合的DNA不被切割在胶上显示出空白区，仅看到有空白区不够啊，只能证明确实跟这个蛋白结合了，但是结合的特定部位的序列如何得知？ |
3楼2013-09-20 05:41:53
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4楼2013-09-20 11:34:22
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kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-09-20 20:00:36
hqc87: 金币+10, 谢谢回复 2013-09-21 05:22:22
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用 Chromatin Immunoprecipitation Assays能够直接 确定DNA与Protein相互作用的直接的结合的DNA片段。请见： Trygve O. Tollefsbol edits,Epigenetics Protocols(MMB-287)，Huamana Press,2004 http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6383180 也就是ChIP。 |
5楼2013-09-20 11:54:22
hqc87
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CHIP确实能检测特定蛋白结合的DNA序列，但是由于条件限制（制备抗体、沉降的DNA片段大量测序等）且目前还不知道该蛋白的功能性，所以估计老板不会同意，而我的情况是已经知道该蛋白结合到我的特定启动子上了，也就是有了这么一个750bp的范围了，感觉做CHIP也有点太多了，因为CHIP可以检测整个基因组。所以还是考虑做下DNA footprinting吧，虽然比较麻烦要用到放射而且还要跑我不太清楚的测序胶，但是只能这样了，如果您有好的DNA 足迹法详细protocol（要从蛋白原核表达到足迹后对足迹片段测序的完整步骤的，最关键的是对足迹片段测序这一步骤），麻烦推荐一下，谢谢热心回复。 |
6楼2013-09-21 05:21:54
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【答案】应助回帖
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足迹法保护的DNA片段测序就用以化学法或者sanger法为基础的自动测序仪测序，遇到有修饰碱基则位点在机器上读不出来，但是其他位点能读出。面对这样的情况，用限制性内切酶，从离未知位点的最靠近的已知序列的用限制性内切酶位点处切开，然后把带有遇到有修饰碱基则位点在机器上读不出来的DNA片段用质谱鉴定即可。 带有遇到有修饰碱基则位点在机器上读不出来的DNA片段用质谱鉴定实际上就是把dsDNA fragments变为ssDNA fragments，然后通过质谱测定出修饰碱基的特异性断裂的分子量，从相关数据库中搜索到有关碱基的分子量确定该碱基的类型，这部分有质谱仪自身的软件和网络数据库完成。 |
7楼2013-09-21 10:14:55
