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08olive

新虫 (初入文坛)

[求助] 如何确定一个基因转录本能不能表达蛋白？

获得一个基因的几个不同转录本，想知道这几个转录本有没有相应的活性蛋白表达？
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1楼 2013-06-14 13:24:09
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
用质谱检测表达前后有没有新的符合目的蛋白质的相对分子质量的质谱峰出现，有则用分子筛层析分离出该产物，并测定其是否具有目的产物蛋白质的生物功能。
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2楼2013-06-14 23:26:38
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

用质谱检测表达前后有没有新的符合目的蛋白质的相对分子质量的质谱峰出现，没有不代表基因未表达，也有可能表达后被水解，因此应该加入蛋白酶的抑制剂再看看。也可以从转绿本组角度看看是否有表达该种蛋白质的特定的成熟的mRNA出现。
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3楼2013-06-14 23:29:34
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08olive

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-06-14 23:26:38
用质谱检测表达前后有没有新的符合目的蛋白质的相对分子质量的质谱峰出现，有则用分子筛层析分离出该产物，并测定其是否具有目的产物蛋白质的生物功能。

表达前后？是不是构建几个转录本的表达载体，转染细胞，抽提转染前后的蛋白做质谱检测？
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4楼2013-06-16 21:45:47
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by 08olive at 2013-06-16 21:45:47
表达前后？是不是构建几个转录本的表达载体，转染细胞，抽提转染前后的蛋白做质谱检测？...

可以这样做，也可以控制诱导条件的前后对于可能还有表达产物的样品（可以粗分离）进行质谱检测。不必纯化蛋白质，直接做质谱搜索不不同条件下的样品的m/z峰即可。
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5楼2013-06-17 01:15:47
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
08olive: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-06-17 12:55:36
如果不知道表达产物的样品（目的蛋白质）的特异性的m/z峰，那么更谨慎一些，可以直接用目的蛋白质标准品做一次质谱，作为比对和搜索的标准峰。因为不纯化样品时可能峰比较杂。如果做粗分类，甚至做了离子交换层析，那么一定要注意，对于载体的基因表达的情况和为表达的情况下的同部分细胞提取液样品，必须做同样的分离，否则“本底”的m/z峰可能会变化较大，而使得分析m/z峰的困难增加。
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6楼2013-06-17 01:22:56
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