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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 高手请进--金黄色葡萄球菌的electroporation问题
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yuliansheng

金虫 (小有名气)

[求助] 高手请进--金黄色葡萄球菌的electroporation问题

各位虫友们，
      目前这个问题已经困惑我了将近半年的时间，真心的恳请虫友们帮帮我。
       为了做一个临床株的mutant strain， 我需要将一个重组的plasmid通过electroporation导入到这个金黄色葡萄球菌中。已经几乎确定过了所有步骤没有弄错--先酶切质粒和target DNA--进行ligation之后--tansformation到E.coli(DH5a)--electroporation到RN4220--细菌正常长出--再提质粒--electroporation到这个临床株的competent cells-------------什么也没长出来（大概做了几十次，从检查competent cells到重组plasmid测序及PCR确认等等）！！！
     真心着急，pasmid进不去，就做不了mutant strain，实验就不能继续往下进行。希望虫友们能给出一些指点，建议，和一些相关资料能供我学习。在此，先谢过了！！
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学习....
1楼 2013-09-09 21:30:51
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妳口妳口

新虫 (小有名气)
实验急需RN4220菌株，没买到，请问楼主从哪里购买的？是否能够馈赠我一份，或者卖给我一份，十分感谢
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2楼2013-09-10 16:44:25
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妳口妳口

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待更详细的解答 2013-10-10 09:57:43
楼主你的感受态会不会有问题？革兰氏阳性菌的感受态做法不一样的
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3楼2013-09-10 16:46:07
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yuliansheng

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 妳口妳口 at 2013-09-10 16:44:25
实验急需RN4220菌株，没买到，请问楼主从哪里购买的？是否能够馈赠我一份，或者卖给我一份，十分感谢

这位仁兄，不好意思，我在日本留学，要是在国内的话就送你一份了。
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学习....
4楼2013-09-13 14:21:20
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yuliansheng

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 妳口妳口 at 2013-09-10 16:46:07
楼主你的感受态会不会有问题？革兰氏阳性菌的感受态做法不一样的

我用的是专门的金黄色葡萄球菌的感受态细胞的制作方法，这应该不会有问题。但如果有更好的制作感受态细胞的方法的话，我倒是想借鉴一下。
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学习....
5楼2013-09-13 14:23:45
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yangtingli

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
myprayer: 金币+5, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待更详细的解答 2013-10-10 09:57:53
yuliansheng: 金币+5, ★有帮助, 我知道你说的这些方法，我也是先电转质粒到RN4220，然后再提质粒，电转到我所研究的临床aureus株。试了好多好多次，包括电转条件，加入质粒的量等等，都没能成功导入质粒。你说的那篇文章我也读过，也试过里面所说的方法，也没能成功。（你所说的那篇文章是Transforming the Untransformable: Application of Direct Transformation To Manipulate Genetically Staphylococcus aureusand Staphylococcus epidermidis） 不过还是很感谢你。还有其他的方法或关于这方便的信息吗？ 2013-10-28 19:33:49
你直接用质粒 电转 RN4220 时，可以加大质粒用量，可以加到5ug，提高电转效率。
另外，也不可以试试不借助RN4220，我不知道，你最终要把质粒放在哪个菌株。
在你做转化时，转入了DH5a, 这一步，可以用 E.coli DC10B，这是个为转化S.aureus设计的菌株，E.coli DH10B的突变体。 我是直接转进 DC10B, 然后提取质粒 鉴定， 电转 S.aureus Newman，中间不经过RN4220，还挺容易的。
你可以找下 E.coli DC10B的文献
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6楼2013-10-10 06:09:18
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tanxiaojuan

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 妳口妳口 at 2013-09-10 16:44:25
实验急需RN4220菌株，没买到，请问楼主从哪里购买的？是否能够馈赠我一份，或者卖给我一份，十分感谢

我也急需RN4220，你在哪买到的，或者馈赠我一份，或者卖给我一份。谢谢！
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7楼2013-10-24 09:47:20
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lzhang-sc

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by yuliansheng at 2013-09-13 14:23:45
我用的是专门的金黄色葡萄球菌的感受态细胞的制作方法，这应该不会有问题。但如果有更好的制作感受态细胞的方法的话，我倒是想借鉴一下。...

你好，我也是在将质粒转入金黄色葡萄球菌这步卡住了，请问你能提供金黄色葡萄球菌感受态的制备方案吗，不胜感激！
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8楼2013-12-30 10:32:39
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hhw19890207

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by yangtingli at 2013-10-10 06:09:18
你直接用质粒 电转 RN4220 时，可以加大质粒用量，可以加到5ug，提高电转效率。
另外，也不可以试试不借助RN4220，我不知道，你最终要把质粒放在哪个菌株。
在你做转化时，转入了DH5a, 这一步，可以用 E.coli DC1 ...

师兄，你好！构建金突变株遇到了质粒转化的问题。我尝试过将空质粒pMAD直接转入金葡菌而不用RN4220，虽然提不出质粒，但通过菌落PCR以及测序证实空质粒转进去了，但后续构建的重组质粒无法转进去？
请问有解决办法吗，期待您的回复！
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期望共同进步
9楼2015-09-15 20:28:37
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YaBoBo

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by yuliansheng at 2013-09-13 14:23:45
我用的是专门的金黄色葡萄球菌的感受态细胞的制作方法，这应该不会有问题。但如果有更好的制作感受态细胞的方法的话，我倒是想借鉴一下。...

我是第一次做金葡菌  做的感受态转不进去质粒  可能是我的感受态细胞制备的不成功    金黄色葡萄球菌的感受态细胞的制作方法    希望您不吝赐教
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10楼2015-12-18 11:09:26
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